荧光探针技术的原理（陕西教授团队取得）

荧光探针技术的原理（陕西教授团队取得）最后，为了证实APO是通过抑制NOX-2活性导致ROS含量降低，最终实现脑卒中的治疗，本工作利用DHE染色和Western blot实验评估了小鼠大脑的ROS水平和炎症水平。结果显示，随着MCAO时间的增加，ROS含量显著上升，同时NOX-2含量增加，炎症因子（NLRP3和IL-1β）含量也随之增加，表明脑卒中可通过诱导ROS导致小鼠发生神经炎症反应。同时，APO可有效抑制上述指标，表明APO可通过调控NOX-2蛋白活性从而降低小鼠脑卒中诱导的炎症反应。同时，利用中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）法模拟小鼠脑卒中过程荧光强度同样观察到上述变化。TTC染色实验表明，随着MCAO时间的增加，脑梗面积逐渐增大，脑卒中程度增高。而NOX-2抑制剂罗布麻宁（Apocynin，APO）能够有效降低脑梗面积，因此具有治疗脑卒中的能力（如上图所示）。神

近期，陕西科技大学强涛涛教授团队联合英国巴斯大学James. Tony D.教授团队取得了一系列研究成果，相关成果分别以“Imaging of Hypochlorous Acid in Mitochondria using an Asymmetric Near-Infrared Fluorescent Probe with Large Stokes Shift”，“Simultaneous tracking of autophagy and oxidative stress during stroke with an ICT-TBET integrated ratiometric two-photon platform”和“Near-infrared fluorescent probe for hydrogen sulfide: high-fidelity ferroptosis evaluation in vivo during stroke”为题，发表于Chemical Science。论文第一作者为陕西科技大学博士后胡伟博士，通讯作者为强涛涛教授和英国巴斯大学James. Tony D.教授。

以荧光探针为基础的荧光成像作为一种直观、原位的可视化观测技术在生物检测方面得到了广泛应用。其中，近红外荧光探针由于具有光毒性小、组织穿透能力强和自体荧光干扰小等优点，在用于实时检测和跟踪生物活性物种等方面备受青睐。然而，现有的近红外荧光探针大多存在Stokes位移小（＜ 50 nm）的缺陷，必将导致激发光谱和发射光谱之间的严重串扰，造成成像时信噪比低以及严重的荧光自猝灭现象，大大影响探针检测的灵敏度和可靠性。

最近的研究表明通过增强荧光染料电子供体部分的供电子能力以增加分子ICT效率进而影响荧光染料的内转换效率，不仅可以增加染料的Stokes位移，而且还可增加其摩尔吸光系数，虽然该策略往往会牺牲掉分子的量子产率，但其荧光亮度（摩尔吸光系数与量子产率的乘积）却有提升。

近期，陕西科技大学强涛涛教授团队联合英国巴斯大学James. Tony D.教授团队，利用罗丹明染料氧杂蒽部分并入含S原子的稠环，其增强的不对称性有效增加了荧光团的Stokes位移，同时该刚性稠环也使得发射波长红移到近红外区。接着引入螺环双酰肼作为次氯酸的特异性识别基团、吡啶鎓离子作为线粒体靶向基团，构建出兼具大Stokes位移和线粒体靶向功能的近红外次氯酸探针，并用于脑卒中过程中线粒体内HOCl水平的检测及成像分析。

本工作首先比较荧光团TJ730和另两个罗丹明衍生物荧光团RhB和DQF-RB在EtOH溶剂中的光谱性质。如上图所示，RhB在553 nm处出现最大吸收，而相应的发射最大值在567 nm处，可以观察到吸收和发射光谱具有非常严重的重叠（Stokes位移仅为14 nm）。DQF-RB在597 nm具有一个突出的吸收带，并且在682 nm具有相应的最大发射。Stokes位移明显增加（85 nm），但吸收光谱和发射光谱之间仍存在相当大的重叠。TJ730在606 nm处显示出最大吸收峰，在751 nm处显示出最大发射。激发和发射光谱的几乎完全分离（Stokes位移达145 nm）可产生更高的信噪比，并可有效避免在活体成像过程中荧光自猝灭。同时，本工作利用密度泛函理论和含时密度泛函理论在B3LYP/6-31G (d)水平上计算了RhB、DQF-RB和TJ730在EtOH中的基态（S0）和第一激发单重态（S1）的几何形状和电子结构，进一步确认了染料TJ730大Stocks位移的发生机理。

随着NaOCl浓度的增加，探针WD-HOCl在751 nm处的荧光强度增加了29.9倍，在0.05～20 μM浓度范围内存在线性关系。探针WD-HOCl对HOCl的检出限计算为1.5 nM，且在100 s内基本反应完全，表明WD-HOCl对HOCl表现出快速响应，满足对生物体内HOCl进行快速检测的要求。更为重要的是，生命体内干扰物无法引起探针荧光强度的改变，表明探针WD-HOCl对HOCl具有高度的选择性。

利用药物抑制（Apocynin，APO）和基因沉默（NOX-2KD）的方式抑制NOX-2蛋白表达，证明氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）过程可导致NOX-2蛋白过表达从而引起细胞发生氧化应激的发生。如上图所示，NOX-2KD组相比于OGD/R组，荧光信号均有明显降低，同时，阴性对照组的比率信号相比于NOX-2KD组有明显升高。以上实验充分说明NOX-2蛋白可以调控细胞发生氧化应激状态。Western blot也证明了研究观点的准确性。更重要的是，流式细胞术实验表明通过抑制NOX-2的表达可有效改善OGD/R过程对细胞的损伤。

同时，利用中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）法模拟小鼠脑卒中过程荧光强度同样观察到上述变化。TTC染色实验表明，随着MCAO时间的增加，脑梗面积逐渐增大，脑卒中程度增高。而NOX-2抑制剂罗布麻宁（Apocynin，APO）能够有效降低脑梗面积，因此具有治疗脑卒中的能力（如上图所示）。神经功能评分和小鼠打转次数评估也显示出与TTC染色实验结果相同，再次证明APO可有效治疗脑卒中。

最后，为了证实APO是通过抑制NOX-2活性导致ROS含量降低，最终实现脑卒中的治疗，本工作利用DHE染色和Western blot实验评估了小鼠大脑的ROS水平和炎症水平。结果显示，随着MCAO时间的增加，ROS含量显著上升，同时NOX-2含量增加，炎症因子（NLRP3和IL-1β）含量也随之增加，表明脑卒中可通过诱导ROS导致小鼠发生神经炎症反应。同时，APO可有效抑制上述指标，表明APO可通过调控NOX-2蛋白活性从而降低小鼠脑卒中诱导的炎症反应。

本工作开发了一例近红外HOCl荧光探针WD-HOCl，该探针具有大的Stokes位移（155 nm，激发和发射峰几乎完全分离）和良好的线粒体靶向能力，可用于小鼠脑卒中过程的生物成像和HOCl水平评估。探针WD-HOCl能在100 s内与HOCl快速完成反应，且不受其他ROS和RNS的干扰，选择性好、灵敏度高（LOD为1.5 nM）。该探针可检测细胞外源性和内源性HOCl，并能特异性地在线粒体内积累。探针WD-HOCl被成功应用于监测细胞OGD/R模型中HOCl水平的变化，并对小鼠MCAO模型进行HOCl的荧光成像分析，表明脑卒中可通过诱导ROS导致小鼠发生神经炎症反应，而APO则可通过调控NOX-2蛋白活性以降低炎症反应的程度。因此，WD-HOCl显示出作为生物分析和医学诊断工具的潜力。

作为陕西省“国内一流大学建设高校”，陕西科技大学一直聚焦科技前沿、国家战略、国民经济主战场、生命健康，高度重视科技创新，积极为经济社会发展服务。“十三五”以来，学校共承担各类纵向科研项目2094项，获得科技成果奖励259项，省部级以上奖励122项，出版著作116部，SCI二区以上收录论文1834篇，EI收录期刊论文520篇，授权国内发明专利2564件，国外专利61件。连续9年位居全国高校有效发明专利拥有量排名前50位、陕西省属高校第1位；进入“最新中国高校专利转让榜单”20强，成为国家80所知识产权试点示范高校之一。

延伸阅读：

强涛涛，男，1980年2月生，陕西科技大学教授、博士生导师。研究方向：高分子材料，有机-无机复合材料，生物质基功能材料。曾获中国轻工业联合会科学技术发明一等奖、陕西青年科技奖、陕西省科技进步二等奖等多项荣誉、奖励。

更多精彩资讯，欢迎关注头条号：陕西科技大学招生办

注：文章部分素材来自今日论文、陕西科技大学轻工科学与工程学院