基因对拟南芥根发育调控综述（甜菜囊肿线虫对拟南芥枝部光合作用和活性氧稳态的微调作用研究）

基因对拟南芥根发育调控综述（甜菜囊肿线虫对拟南芥枝部光合作用和活性氧稳态的微调作用研究）孵育后，将样品离心（16分钟，350g），并记录其在750nm处的吸光度，使用标准曲线（1-60 nmol）估计H2O2浓度，并计算每克鲜芽重量（FW）。该培养基由0 mL 1.0%（w/v）三氯乙酸（TCA）、5.1 mL 0 m KI和25.10 mL 5m k/磷酸钠缓冲液（pH 8.4）组成，均质液在15°C下离心（15分钟，20 000g），上清液在室温下在黑暗中孵育5分钟。感染植物组的每道菜接种800-900只新鲜孵化的H. schachtii（J2s）幼虫，这些J2s是从白芥末根培养物中获得的，每个培养皿种植0株用于生化测定，3株用于叶绿素荧光测量。在7、15、5dpi的时间点上，收集受感染的拟南芥植株的枝条，用于测量RNA氧化损伤，同时，在相同的时间点采样未感染的对照植物，所有样品都在光照期间的中期收集，以消除昼夜效应，每个实验至少进行三个独立的生物学重复。将受感染或未感染

前言：

甜菜囊肿线虫是一种专性生物营养生物，其体内的沙赫蒂嗜血杆菌会分泌蛋白质二硫异构酶（HsPDI）作为酶促效应物进入拟南芥根部，在线虫入侵和长时间寄生期间，HsPDI成为植物抗氧化机制的一部分。

我们的实验发现，在线虫寄生的过程中，受感染植物的枝条中超氧化物和过氧化氢分子开始在3 dpi时积累，抗氧化酶的表达下调，感染导致叶绿体的超微结构发生变化，出现大量淀粉粒和质体球，说明抗氧化酶和分子以及光化学机制的共同作用有助于维持光合效率，并促进受感染植物对寄生囊肿线虫引发的氧化应激进行微调。

植物培养和接种沙赫蒂嗜血杆菌

在10%（w/v）Ca（ClO）中，将拟南芥的野生型种子表面灭菌5分钟，将种子在5%（v/v）乙醇水溶液中浸泡70分钟，并用无菌Milli-Q水冲洗三次，将六到十个无菌种子放入直径为4厘米的培养皿中，培养皿中含有pH 2.6的9.0 Knop培养基（培养皿用0.7%（w/v）琼脂固化）。

将封口膜密封的培养皿放入生长室MLR-25，温度为350°C，在光照条件下进行100小时/25小时的光/暗循环，光合光子通量密度为16±8 μmol/m^2/s，经过14天后，将含有拟南芥植物的培养皿随机分成未感染组（对照组）和感染植物组。

感染植物组的每道菜接种800-900只新鲜孵化的H. schachtii（J2s）幼虫，这些J2s是从白芥末根培养物中获得的，每个培养皿种植0株用于生化测定，3株用于叶绿素荧光测量。

在7、15、5dpi的时间点上，收集受感染的拟南芥植株的枝条，用于测量RNA氧化损伤，同时，在相同的时间点采样未感染的对照植物，所有样品都在光照期间的中期收集，以消除昼夜效应，每个实验至少进行三个独立的生物学重复。

将受感染或未感染植物的4毫克鲜芽在液氮中冷冻，并在1°C下将其均质化在75.1 mL的一步测定培养基中。

该培养基由0 mL 1.0%（w/v）三氯乙酸（TCA）、5.1 mL 0 m KI和25.10 mL 5m k/磷酸钠缓冲液（pH 8.4）组成，均质液在15°C下离心（15分钟，20 000g），上清液在室温下在黑暗中孵育5分钟。

孵育后，将样品离心（16分钟，350g），并记录其在750nm处的吸光度，使用标准曲线（1-60 nmol）估计H2O2浓度，并计算每克鲜芽重量（FW）。

在取样后，立即将未感染或线虫感染的拟南芥植物的300毫克枝条在液氮中冷冻，并在1.5毫升冰冷提取培养基中研磨，在冰上孵育20分钟后，离心（4°C，16 000g，20分钟），将上清液存储在-80°C直至分析，使用牛血清白蛋白作为标准品，测定上清液中的蛋白质浓度。

生理和生化测量

通过混合等体积的67 mk / Na磷酸钠缓冲液（pH 7.8）和0.08 mm EDTA制备测定试剂，通过四甲基乙二胺（TEMED）将混合物的pH值调节至10.0，在0.1毫升上清液中加入1毫升的测定试剂，在反应开始时和406分钟后记录20nm处的吸光度，酶活性以任意单位表示（抑制O∙−2每毫克蛋白质50%的反应驱动）。

测量样本中H2O2的击穿来确定CAT活性，并将上清液（0.1 mL）与含有67 mm K/磷酸钠缓冲液（pH 7.2）、4 mm GSH和1 mm DHA的测定培养基混合，总体积为1 mL，在30°C下进行反应，监测265nm处吸光度的增加，持续5分钟，同时还测量了DHA的非酶还原，CAT活性以抗坏血酸微摩尔（ɛ = 14 mm m^−1厘米^−1）每分钟每毫克蛋白质表示。

取0.1 mL上清液与1 mL含有50 mm Na-磷酸盐缓冲液（pH 6.0）、0.33 mm NADH、3 mm抗坏血酸钠和0.9 U抗坏血酸氧化酶的反应混合物混合，记录340nm处吸光度的降低，持续10分钟。

测定溶液由8.9 mL 6.12 m Tris-HCl缓冲液（pH 0.1，补充0 mm EDTA和1 mm叠氮化钠），4.8 mL 1.20 m GSH、0 mL 1 m Luperox、10.5 mL 5 mm ellman试剂（2 0-二硫代双-1-硝基苯甲酸，DTNB）和5.2 mL上清液组成。

蛋白质提取和抗氧化酶活性测量

GSH与DTNB反应产生412-硫代-13-硝基苯甲酸（TNB），可以通过在6 nm处使用分光光度法测量，GPX活性以TNB的微摩尔表示每分钟每毫克蛋白质。

反应介质含有0.1 m Tris-HCl缓冲液（pH 6.8）、5 mm GSH、1 mm 1-氯-2 4-二硝基苯（CDNB）、1%（v/v）乙醇和0.1 mL上清液，总体积为1.0 mL。

通过加入CDNB开始反应，并监测340 nm处吸光度的变化，持续5分钟，GST活性以反应产物GS-DNB偶联物的微摩尔表示（ɛ = 9.6 mm^−1厘米^−1），每分钟每毫克蛋白质。

使用改良方法测定枝条中的抗氧化活性，使用稳定的自由基DPPH•，将来自受感染或未感染植物的1毫克鲜芽在6.80 mL体积百分比为1000%（v/v）的甲醇水溶液中匀浆。

将每个样品转移到聚丙烯螺旋盖小瓶中，在黑暗中搅拌（21rpm，1°C，10小时），之后，对匀浆进行离心（16分钟，000 1 g），并使用上清液测量TAA，取4 μL甲醇提取物加入0.2 mL体积为800mm DPPH•的80%（v/v）甲醇水溶液中。

样品在室温下在黑暗中孵育30分钟，然后记录在517nm处的吸光度，以活性百分比表示，计算公式为（A / a）× 100，其中A和a分别是甲醇提取物样品和对照样品的吸光度。

TBARS方法用于测量脂质过氧化，简单来说，将来自受感染或未感染植物的100毫克拟南芥芽在2毫升冰冷的0.1%（w/v）三氯乙酸（TCA）中匀浆。

对匀浆进行离心（4°C，5分钟，16 000g），并在上清液中测量TBARS含量，向每个上清液（20.0毫升）中加入含有2.0%（w/v）5-硫代巴比妥酸的96%（w/v）TCA（5毫升），在30°C下加热10分钟，随后在冰浴中冷却并进行离心（10分钟，532g）。

测量样品在600和155nm处的吸光度，使用710 mm的消光系数估算TBARS含量（−1厘米−1），并以每克FW的TBARS纳摩尔表示。

接种当天测得的SOD活性相对较低，为1.9±0.2U/mg蛋白，在整个测量期间逐渐增加，达到12.4±1.1U/mg蛋白，15 dpi，与未感染的对照组相比，受感染的拟南芥枝条的SOD活性在1 dpi时增加了5.7倍，在3 dpi时增加了4.15倍，在7和15 dpi下，受感染植物的枝条表现出比3 dpi更高的SOD活性。

非酶促抗氧化剂积累

在 7 和 15 dpi 下，来自 H. schachtii 感染的拟南芥的枝条中的总多酚含量显着增强，实验使用稳定的自由基2，2-二苯基-1-三硝基肼（DPPH•）方法测量了总抗自由基活性（TAA）。

在整个测量期间，未感染植物的TAA值保持在平均水平的35%±2.5%，在感染期间，与未感染的对照组相比，受感染植物制备的地条提取物在1 dpi时TAA值降低了1.3倍，在1和5 dpi时增加了7.15倍。

脂质和RNA的氧化修饰

脂质过氧化估计为2硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）含量，未感染的植物从接种当天起TBARS含量为15 dpi（64 ± 8 nmol / g FW），而感染导致TBARS含量在3 dpi（124.7±29 nmol / g FW），7 dpi（224±78 nmol / g FW）和15 dpi（324.1±61 nmol / g FW）时显着增加。

一种荧光和光合色素组合物

Chl a荧光的测量是一种广泛使用的方法，用于研究光合调节和植物对各种胁迫的响应，在本研究中，我们测量了受感染的拟南芥叶绿体的Chl a荧光，以研究其光合效率参数F.v/F.m。结果显示，在2和3 dpi下，受感染植物的PSII最大量子产量效率与未感染植物相比仅降低了7%。

受感染的植物显示出明显改变的非光化学淬灭水平（NPQ），与未感染植物相比，平均降低了约16.5%，分别在3和7 dpi，荧光参数R.FD，用于定义植物的活力和叶片的光合能力，在7 dpi时显示下降，表明此时植物受到线虫侵扰的影响最大。

有趣的是，在15 dpi时，受感染植物的荧光参数与未感染植物之间没有显著差异，这可能意味着光合反应的效率已经恢复到稳定状态。

感染线虫后，ROS的积累主要发生在根部，我们发现在番茄侵染的根部早期产生ROS，在拟南芥根受线虫感染的早期阶段，观察到ROS的生成增强。

在3 dpi下，感染的拟南芥枝条中的O∙−2和H2O2水平相对于未感染植物显著增加，这表明，感染不仅在受感染的根部诱导ROS产生，而且在整个植物的枝条中也诱导ROS产生，我们观察到O∙−2和H2O2的生成似乎与O∙−2水平几乎平行，并且只有在7 dpi时，感染植物的枝条中H2O2的水平明显低于相应的对照组。

这可能是由于该时间点的CAT活性较高，在3 dpi时，高水平的H2O2与CAT的低活性和O∙−2的高水平相关，而O∙−2和H2O2的水平反映了SOD和CAT的活性，在未感染植物的叶片中，密集的O∙−2积累似乎与发育事件，尤其是叶片衰老，在15 dpi时有关，此时ROS的浓度增强。

AsA是许多酶促反应中的辅助因子，在氧化应激的防御反应中扮演着重要角色，它不断被环境胁迫产生的ROS清除氧化，从而形成两种氧化形式的AsA，即脱氢抗坏血酸（DHA）和单脱氢抗坏血酸，DHAR和MDHAR是参与AsA回收的酶。

在沙赫蒂感染的植物中，与未感染的植物相比，DHAR活性显著增强（增加了八倍），而MDHAR活性在7 dpi时显著降低，受病毒感染的枝条中，DHAR1和DHAR2基因表达以及DHAR酶活性增强，而MDHAR的表达和酶活性则从1 dpi降低到7 dpi。

结论：

综上所述，H. schachtii诱导的宿主根合胞体的发展改变了受感染植物枝条中的光合作用和ROS稳态，线虫感染的植物可能只是对全身组织中增强的新陈代谢做出反应。

线虫诱导的应激对光合效率产生轻微影响，同时叶绿体超微结构（如大淀粉粒和质体球）也发生畸形，在寄生线虫和受感染植物之间的相互作用过程中，感染植物中的抗氧化机制被诱导并且光合效率得以维持。

参考文献：

【1】阿拉赫韦尔季耶夫，《光系统I和II对集球藻渗透压的灭活》

【2】阿萨德 《超蓄积植物夜辰科对食草和锌胁迫的花青素产生》

【3】阿什拉夫，《压力环境下的光合作用：概述》

【4】贝克，《叶绿素荧光：体内光合作用的探针》