氧化铜纳米材料抗肿瘤（新型磁性活性氧纳米发生器用于模式转换磁共振成像引导的肿瘤治疗）
氧化铜纳米材料抗肿瘤（新型磁性活性氧纳米发生器用于模式转换磁共振成像引导的肿瘤治疗）
▲共同第一作者：余靓，赵帆，共同通讯作者：侯仰龙，车声雷，牟晓洲
通讯单位：北京大学，浙江工业大学，浙江省人民医院
论文DOI：10.1021/acsnano.9b01740
背景介绍恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康的疾病。发展肿瘤选择性治疗的方案有望在提高疗效的前提下降低治疗的副作用，成为肿瘤治疗领域的研究热点之一。有研究发现，细胞内累积过量的活性氧分子会导致脂质、蛋白和 DNA 分子的损坏，从而引发细胞凋亡。如何在肿瘤部位高效地产生大量活性氧成为肿瘤治疗的一大关键问题。化学动力学疗法是一种利用化学反应产生活性氧来诱发细胞凋亡的新型肿瘤治疗方法。其中，芬顿反应是通过过氧化氢 (H2O2) 与亚铁离子反应产生具有强氧化性的羟基自由基的过程。由于肿瘤内的 H2O2 含量明显高于正常组织，基于芬顿反应的羟基自由基产生是一种利用活性氧实现肿瘤选择性治疗的优选方案；而如何高效且特异性地将亚铁离子输运到肿瘤部位成为这方面研究的目标之一。得益于肿瘤弱酸性的微环境特点，利用酸敏感型的铁基纳米材料可以实现亚铁离子在肿瘤部位的选择性释放，从而有望实现肿瘤的高效与特异性治疗。另一方面，抗肿瘤治疗的疗效存在明显的个体差异，治疗过程中需要因人而异地调整治疗方案。因此，亟需发展能够实时反馈与监测疗效的肿瘤可视化治疗方法。影像学引导的肿瘤治疗将成像与治疗功能整合于一体，有望解决这一问题。
然而，目前常用的诊疗一体化肿瘤治疗方案，其治疗成分与成像组份一般不是由同一物质组成，提供的影像信息并不一定与治疗信息一一对应。为此，需要发展诊断与治疗功能由同一组分实现的新型肿瘤诊疗方案。研究出发点基于上述问题，近日，北京大学侯仰龙教授课题组与浙江工业大学余靓特聘教授共同发展了一种新型磁性纳米材料，它不但能够针对肿瘤微环境选择性释放活性氧，而且可以基于磁共振成像的模式转换对治疗过程实时监测。利用肿瘤弱酸性的微环境，我们制备了能在酸性条件下释放亚铁离子而在中性环境中稳定的活性氧发生器——Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒。该材料具有比 Fe3O4 纳米颗粒更高的酸敏感性，能在肿瘤环境中释放出更高浓度的亚铁离子。结合肿瘤内高 H2O2 含量的特点，这种 Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒能基于芬顿反应在肿瘤内特异性释放大量羟基自由基，从而实现肿瘤的选择性治疗。相较于商用磁共振成像（MRI）造影剂——Fe3O4 纳米颗粒，高饱和磁化强度的特性又赋予了 Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒更为优异的 T2-MRI 增强能力和磁介导的肿瘤富集效果。更重要的是，在肿瘤部位酸性条件下，Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒被逐渐降解，导致其 T2-MRI 成像效果减弱；同时，随着亚铁离子的释放，其 T1-MRI 信号得到增强。
这种 T2/T1-MRI 信号之间的转变为活性氧产生乃至肿瘤治疗过程的可视化提供了可能。值得一提的是，由于肿瘤治疗与MRI信号转化过程均由 Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒在肿瘤部位降解并释放亚铁离子引起，这种新型磁性纳米材料有望实时提供治疗信息，是一种具有良好前景的新型“原位”诊疗一体化材料。图文解析A. Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒的制备与结构表征Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒通过高温液相法制备得到。TEM、XRD、XPS 等结果显示，颗粒具有核壳结构，整体尺寸约为 20 nm，内核成分为 Fe5C2，外壳是非晶的 Fe3O4 （图1）。
B. Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒的酸敏感性和亚铁离子释放性能在酸性环境中大量释放亚铁离子是基于 Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒诱发芬顿反应的核心。表面非晶 Fe3O4 壳层的包覆使颗粒能够在酸性条件下易于被降解，释放出亚铁离子（图2a）。由于 Fe5C2 是铁与碳的金属间化合物，具有与铁类似的酸敏感性。当 Fe3O4 壳层被酸腐蚀后，暴露的 Fe5C2 成分使其能更高效地释放亚铁离子。
因此， Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒比 Fe3O4 纳米颗粒具有更强的亚铁离子释放能力（图2b）。若将非晶 Fe3O4 壳层替换成碳壳层，由于碳的惰性与保护作用，Fe5C2@C 纳米颗粒的酸敏感性大大降低。释放的亚铁离子能够催化 H2O2 分解，产生具有强氧化性的羟基自由基，并使亚甲基蓝褪色（图2c d）。在 pH 7.4 的生理环境下， Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒能保持结构稳定，几乎不释放亚铁离子，展示了其在正常组织环境中的稳定性与安全性（图2e f）。
C. Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒 pH 响应的 MRI 成像模式转换Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒在酸性条件下的解离与亚铁离子释放过程可以通过MRI实时监控。由于磁性 Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒在中性条件下能保持结构与磁学性能稳定，因此，在pH 7.4 环境下其具有优异的 T2-MRI 性能，r2 值可达到 203.83 L mmol-1 s-1（图3a）。
因而，这种材料可用于磁靶向介导的肿瘤富集，并通过 T2-MRI 对靶向聚集效果进行监测。相比之下，在弱酸性环境中（pH 5.4），Fe5C2@Fe3O4纳米颗粒因被降解而导致其磁学性能减弱，最终使得其r2值可在一天内降低至64.18 L mmol-1 s-1。同时，由于释放的亚铁离子具有增强T1-MRI的效果，在材料分散的环境由中性向弱酸性转变过程中，Fe5C2@Fe3O4纳米颗粒溶液的r1值可由0.26 L mmol-1 s-1升高至1.01 L mmol-1 s-1（图3a b）。
这一MRI信号的转变能在小鼠瘤内注射Fe5C2@Fe3O4纳米颗粒后 24 h 内明显观察到（图3c d），说明材料在肿瘤内能被部分降解，且降解过程可通过 MRI 监测。结合肿瘤内活性氧的产生乃至肿瘤抑制过程均是由释放的亚铁离子催化 H2O2 分解实现的，这种 Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒能利用 MRI 成像模式转变实现治疗过程的监测与疗效评判。
D. Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒肿瘤细胞生长抑制效果由于 Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒的亚铁离子释放行为和 MRI 成像模式转化都具有pH选择性，研究纳米颗粒在细胞内能否进入酸性细胞器显得尤为重要。将 Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒用 FITC 标记并与 4T1 细胞共孵育 4h，进而与不同细胞器共定位并利用生物透射电镜观察。
结果显示，Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒能通过胞吞作用进入溶酶体，并且可在溶酶体的酸性环境中被逐步分解（图4a b）。我们进而以 DCFH-DA 作为活性氧探针，测试材料在细胞内的活性氧产生情况。结果发现，与 Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒共孵育的细胞能产生更强的绿色荧光，说明 Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒能在细胞内高效地催化 H2O2 分解产生活性氧（图4c d）。
值得注意的是，由于肿瘤细胞比正常细胞对活性氧更敏感，Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒能有效地抑制肿瘤细胞的生长，而在正常细胞中展现出较低的毒性（图4e f）。这为材料的高效低副作用肿瘤治疗提供可能。纳米颗粒的磁性能使其可以通过磁靶向作用提高进入细胞的数量，从而进一步增强材料对肿瘤细胞的抑制作用。
E. Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒在荷瘤小鼠上的肿瘤抑制效果磁性 Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒可以通过磁靶向富集于肿瘤部位。结合肿瘤部位弱酸性和 H2O2 高表达的特点，以及纳米材料酸性环境响应的亚铁离子释放与催化 H2O2 产生活性氧的特性，Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒能通过磁场介导在肿瘤部位产生更高浓度的活性氧（图5a），从而更高效得引起肿瘤细胞凋亡（图5b）。荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线表明，这种磁性 Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒能在磁场引导下有效抑制肿瘤生长（图5c）。
另一方面，由于磁靶向作用能降低纳米材料在非肿瘤部位的富集，并且这种基于活性氧的细胞生长抑制具有一定的肿瘤选择性，因此，从小鼠体重、主要脏器 H&E 染色等指标来看，Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒在肿瘤治疗过程中没有产生明显的副作用（图5d）。
总结与展望本工作报道了一种新型的具有核壳结构的 Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒。这种材料能在酸性的肿瘤微环境下释放亚铁离子，通过催化肿瘤高表达的 H2O2 分解产生活性氧，实现肿瘤的高效选择性治疗。此外，Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒具有较高的饱和磁化强度，可以通过磁场引导聚集于肿瘤部位，并通过 T2-MRI 判断其生物分布和这种靶向作用。
再次，随着 Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒在肿瘤部位的降解，其 T2-MRI 成像效果逐渐降低；而释放的亚铁离子又可增强其 T1-MRI 成像效果，从而使 MRI 的信号由 T2 模式向 T1 模式转变。由于肿瘤的治疗与MRI成像模式的转变均由 Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒在肿瘤部位释放亚铁离子实现，本研究为肿瘤的个性化治疗提供了新材料与新思路。在这个工作中，我们也留下了一些遗憾。比如 Fe5C2@Fe3O4 纳米颗粒在体内长期的生物安全性及其代谢过程等机理还没有深入的研究。现阶段，我们正在开展这些方面的探索，希望将来能做出更多更好的工作。
文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.9b01740（点击文末｢阅读原文｣直达原文阅读）
