神经退行性疾病研究动物模型，神经退行性疾病中的经典病理聚集蛋白的超微结构
神经退行性疾病研究动物模型，神经退行性疾病中的经典病理聚集蛋白的超微结构tau蛋白病患者大脑中积累的异常tau蛋白在多个部位高度磷酸化。这些异常形式的tau缺乏与微管结合的能力并显示出各种PTM，例如泛素化、乙酰化、脱酰胺化和氧化以及磷酸化。已显示在AD案例中，这些PTM的配置文件会根据Braak分期阶段而变化。首先，除了在健康大脑中观察到的磷酸化外，富含脯氨酸和C末端结构域的位点数量和磷酸化频率随着Braak分期阶段的进展而增加。此外，微管结合域中的泛素化和乙酰化在Braak后期变得更加突出，这表明这些PTM可能在NFT 形成后充当降解信号。除了tau蛋白病常见的PTM外，还报告了疾病特异性 PTM。S356的非磷酸化和N279的脱酰胺是从AD病例中提取的不溶性tau的显著特征。PiD是唯一一种S262未被磷酸化的tau蛋白病。在CBD中检测到多种疾病特异性泛素化（K343、K353、K369和K375），而PSP的特点是泛素化较少。据报道，与其他tau蛋白
导读：
具有构象变化的异常蛋白质在细胞内积聚是神经退行性疾病的定义性神经病理学特征。积聚在患者大脑中的致病蛋白质采用淀粉样纤维结构，并表现出各种超微结构特征。最近的实验证据表明，这些致病蛋白从宿主细胞到受体细胞的朊病毒样传播是神经退行性疾病发病和进展的基础。为了解这些异常蛋白质的超微结构和生化分类，近日东京都医学科学研究所脑与神经科学系的Masato Hasegawa在《Acta Neuropathologica》期刊上发表了题为“Ultrastructural and biochemical classification of pathogenic tau α-synuclein and TDP-43”的综述。作者总结了从神经退行性疾病患者大脑中提取的致病蛋白的超微结构和生化特征，这些蛋白积累了异常形式的 tau、α-突触核蛋白和 TDP-43，基于最近的实验见解讨论了这些疾病特异性特性是如何在大脑中维持的。
tau、α-synuclein和TDP-43病变
神经退行性疾病的病理标志是错误折叠的蛋白质在神经元和/或神经胶质细胞中的积累。1980 年代报道了阿尔茨海默病(AD) 患者大脑中淀粉样蛋白-β(Aβ)和tau 的积累，以异常 tau 包涵体为特征的一组疾病被称为tau病变。1997年和1998年，有报道称α-突触核蛋白（α-syn）是在帕金森病（PD）、路易体痴呆（DLB）和胶质细胞质患者大脑中观察到的路易体（LBs）的主要成分和多系统萎缩(MSA)中观察到的神经胶质细胞胞质包涵体(GCIs)。以异常α-突触包涵体为特征的一组疾病称为突触核蛋白病。2006年，43kDa的TAR DNA 结合蛋白(TDP-43) 被确定为肌萎缩侧索硬化症(ALS) 和额颞叶变性(FTLD)患者大脑中积累的泛素阳性包涵体的主要成分，含异常TDP-43积累的疾病统称为TDP-43蛋白病。这些异常蛋白质具有共同的特征，例如不溶于去污剂、对蛋白酶的抗性和淀粉样纤维结构的形成，并表现出类似朊病毒的特性，诱导正常蛋白质转化为异常形式。此外，在从患者大脑中提取的去污剂不溶性组分中检测到各种翻译后修饰 (PTM)，例如磷酸化和泛素化。而且，对死后大脑连续切片的组织病理学研究表明，这些异常蛋白质的脑内积累与临床症状密切相关，并以刻板的方式扩展。Braak和 Murayama小组都提出了对这些病理的脑内扩展进行分期，这被广泛用于评估疾病进展。在AD中，tau病理首先出现在蓝斑，然后通过大脑边缘系统从海马扩展到大脑皮层。嗜银颗粒性痴呆 (AGD)中，tau病理从环回沿颞叶前部和后部内侧发展，并进一步延伸到中隔、岛叶皮质和前扣带回。在PD中，α突触核蛋白病理从迷走神经背侧运动核沿脑干上行通路扩散到大脑皮层。在DLB中，据报道α突触核蛋白病理学的发展始于嗅球。据报道，在ALS中，TDP-43病理从运动皮层或脑干扩散到颞叶。此外，据报道，在将胎儿多巴胺神经元移植到 PD 患者体内后10-24年，在移植物中观察到α突触核蛋白病理学。这些报告表明异常α-突触核蛋白从宿主细胞释放并掺入移植细胞的可能性。这些报告表明异常α-突触核蛋白从宿主细胞释放并掺入移植细胞的可能性。这些病理学发现表明，在大脑中积累的异常蛋白质像朊病毒一样以自身为模板进行自我扩增，并沿着神经元回路从一个细胞扩散到另一个细胞。这一假设被称为朊病毒样传播，致病性tau、突触核蛋白和 TDP-43 的自我模板化扩增和细胞间传播已在体外和体内实验模型中得到证实。这些实验性传播有力地支持了朊病毒样传播与各种神经退行性疾病的发病和进展有关的观点。目前，神经退行性疾病的治疗仅限于对症治疗，但有望开发新的疾病缓解疗法和靶向朊病毒样传播的药物。
超微结构和生化特征对朊病毒株多样性的影响
Prusiner 提出了朊病毒假说，它提出了朊病毒样传播的想法，作为解释朊病毒疾病发病机制的一种机制。朊病毒是描述不含核酸的蛋白质感染性颗粒的术语。导致克雅氏病和牛海绵状脑病等朊病毒疾病的朊病毒蛋白 (PrP) 在正常状态 (PrPC) 中富含α-螺旋，而当转化为异常形式 (PrPSc)，它形成富含β-折叠结构的淀粉样蛋白。然后，PrPSc充当模板并自我放大。在从患有朊病毒疾病的患者大脑中提取的不溶于洗涤剂的组分中观察到称为朊病毒棒的淀粉样蛋白结构。这种构象变化使PrPSc能够获得与PrPC不同的各种特性。对感染动物和患者死后组织的生化分析表明，PrPSc具有不同于病毒的独特特征，例如对包括煮沸和紫外线照射在内的常规病毒灭活方法具有抵抗力、不溶于洗涤剂以及对蛋白酶的抵抗力。蛋白酶处理的PrPSc的免疫印迹分析检测到低分子量蛋白酶抗性条带，这些条带模式显示出多样性，具体取决于朊病毒疾病的类型和表达PrPC的宿主物种。对蛋白酶的敏感性差异也被报道。PrPSc生化特性的多样性可能反映了 PrPSc的不同构象。在不同构象的PrP“菌株”中，超微结构和生化特征表现的是菌株的特征，而PrPSc的结构信息对于自我扩增至关重要。因此，PrPSc的结构可能对临床症状和发病机制具有重要意义。在实验动物模型中，菌株已被证明具有不同的感染性和潜伏期。目前尚不清楚哪些因素参与了从同一蛋白质形成不同菌株的过程。然而，可能涉及一些辅因子和PTM。最近，已经证明菌株也存在于淀粉样蛋白中，这些蛋白在患有朊病毒病以外的神经退行性疾病患者的大脑中积累。在与神经退行性疾病相关的致病蛋白中，tau、α-突触核蛋白和TDP-43在细胞内积累并显示常见的PTM。此外，有证据表明它们的积累与神经退行性变化之间存在密切联系。因此，我们在这里专注于对这三种蛋白质的神经退行性疾病特异性菌株的超微结构和生化特征进行分类。
源自人tau病变的致病性tau的超微结构和生化分类
Tau是一种微管相关蛋白，主要位于轴突中，是天然未折叠蛋白之一。在成人大脑中，tau以六种亚型存在，由352-441个氨基酸组成，由编码tau的MAPT基因中的外显子2、外显子2和3 或外显子10的可变剪接产生。在由外显子2和3编码的N末端重复结构域中具有0、1 或2个插入片段的同工型分别称为0N、1N和2N。此外，根据微管结合域中的重复次数，这些tau亚型分为三种重复tau (3R tau) 和四重复tau (4R tau)。3R tau与4R tau的表达比例约为 1:1。在生理条件下，tau的作用是稳定微管并促进它们的聚合。Tau病变分为三组：一类是3R tau和 4R tau积累，一类是只有3R tau积累，一类是只有4R tau积累。在AD和慢性创伤性脑病 (CTE) 中，人类tau的所有六种亚型都以神经原纤维缠结 (NFT) 和神经纤维丝的形式积累（图1a）。在AD的早期阶段，用光学显微镜可以看到没有明显纤维结构的tau阳性沉积物，这些被称为前缠结。然而，电子显微镜研究揭示了前缠结中的纤维结构，表明前缠结中的tau纤维并不像NFT那样密集排列和散开。前缠结的出现可能代表了NFT形成的初步阶段。Braak小组用AT8免疫阳性tau评估了缠结前阶段，此外还用Gallyas银染法评估了NFT阶段。星形细胞缠结也是CTE中的一种神经病理学特征。原发性年龄相关tau病变(PART)的特征是缺乏Aβ积累，并且与AD的NFTs难以区分。在皮克病 (PiD) 中，3R tau作为皮克体在神经元中积累，通常位于大脑皮层第2层和齿状回的中间神经元中（图 1b）。在4R tau病变中，4R tau以各种病理形式积聚在神经元和神经胶质细胞中。进行性核上性麻痹 (PSP) 以簇状星形胶质细胞为特征，而皮质基底结节变性 (CBD) 以星形胶质细胞斑为特征（图 1c、d）。在AGD中，4R tau 在神经元和嗜银颗粒中以前缠结的形式积累（图 1e）。球状胶质tau蛋白病 (GGT) 的病理特征是胶质细胞中的球状tau 阳性包涵体。尽管大多数tau蛋白病是散发性的，但据报道MAPT基因的外显子和内含子中的50多个突变与 tau 蛋白病的发生有关，这些病例被称为与17号染色体相关的额颞叶痴呆和帕金森病(FTDP-17T)。据报道，MAPT基因的错义突变会改变正常tau的结构并促进tau聚集体的形成。此外，MAPT基因内含子区域的突变影响可变剪接并改变3R tau和4R tau的表达比率。这些内含子突变导致tau蛋白病的发生，其临床症状和病理学与tau亚型积累的tau蛋白病相似（图 1f）。
tau蛋白病患者大脑中积累的异常tau蛋白在多个部位高度磷酸化。这些异常形式的tau缺乏与微管结合的能力并显示出各种PTM，例如泛素化、乙酰化、脱酰胺化和氧化以及磷酸化。已显示在AD案例中，这些PTM的配置文件会根据Braak分期阶段而变化。首先，除了在健康大脑中观察到的磷酸化外，富含脯氨酸和C末端结构域的位点数量和磷酸化频率随着Braak分期阶段的进展而增加。此外，微管结合域中的泛素化和乙酰化在Braak后期变得更加突出，这表明这些PTM可能在NFT 形成后充当降解信号。除了tau蛋白病常见的PTM外，还报告了疾病特异性 PTM。S356的非磷酸化和N279的脱酰胺是从AD病例中提取的不溶性tau的显著特征。PiD是唯一一种S262未被磷酸化的tau蛋白病。在CBD中检测到多种疾病特异性泛素化（K343、K353、K369和K375），而PSP的特点是泛素化较少。据报道，与其他tau蛋白病不同，AGD病例中的tau蛋白沉积物缺乏K279的乙酰化。已知异常tau不仅在大脑中增加，而且在tau病变患者的脑脊液(CSF)和血液中也增加。据报道，异常tau流入CSF和血液可能是与衰老相关的血脑屏障破坏的结果，并且CSF和血浆中tau的特定磷酸化位点可用作生物标志物来识别tau蛋白病的早期阶段。已知神经丝蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在tau病理学中显示出共免疫反应性，并且神经丝轻链被用作神经变性的生物标志物。据报道，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖参与致病性tau的细胞间传播。
图1 从人类tau病中提取的致病性tau的超微结构和生化特征
在tau蛋白病患者的大脑中，异常的tau蛋白以富含β折叠的淀粉样细丝的形式积聚。1963年，在电子显微镜研究的基础上，首次报道了AD患者大脑中的纤维结构。此外，据发现，这种扭曲的纤维结构是由两条原丝组成的tau丝，称为成对螺旋丝 (PHF)，并且在AD患者的大脑中观察到PHF和直丝(SF)。从AD病例中提取的不溶于肌氨酰部分的电子显微镜显示PHF的直径为10-20nm，并以80nm 的周期性扭曲，而SF的直径为15nm；在其他tau病变中，异常tau也会形成各种疾病特异性纤维结构。从PiD病例中提取的Tau丝直径为13-17nm，直的或扭曲的；来自PSP案例的直径15nm的Tau丝是松散扭曲的丝带，而来自CBD案例的Tau丝的直径为10-30nm，并以140nm的周期性扭曲；在FTDP-17T（内含子10突变 14和 16）中，直径7-25nm 的tau细丝以240nm的周期性扭曲，这些结构与从 PSP和CBD病例中提取的细丝不同；来自GGT的Tau丝呈带状，而来自AGD的 Tau丝以相对较长的周期性扭曲（图1g）。近年来，低温电子显微镜 (cryo-EM) 分析从tau蛋白病患者的大脑中提取的不溶于肌氨酰的部分，揭示了表现每种疾病特征的tau丝的核心结构。在一名AD患者的大脑中发现了由3R tau中的V306-F378和4R tau中的G304-E380组成的C形核心结构（表1）。尽管PHF和SF中的原丝具有共同的折叠，但原丝的界面不同。从多个AD病例中提取的不溶性组分中也发现了AD折叠，从一个产生Aβ的APP基因V717F突变的家族性AD病例中提取的tau丝结构与散发性AD病例的结构相同。在包括PART、后皮质萎缩 (PCA)、家族性英国痴呆 (FBD) 和家族性丹麦痴呆 (FDD) 在内的其他tau病变以及包括PrP 脑淀粉样血管病和Gerstmann-Sträussler-Scheinker病(GSS)在内的朊病毒疾病中也发现了与散发性AD病例相同的Tau丝结构。在CTE病例中，确定了由3R tau 中的K274-R379和4R tau中的S305-R379组成的纤维核心结构，并且CTE折叠不同于AD折叠。CTE折叠中也存在非蛋白质分子。从PiD病例中提取的tau丝的J形核心结构涉及3R tau中的K254-F378，虽然大多数丝为单原丝类型，但也发现了由两条原丝组成的扭曲丝。从CBD病例中提取的Tau丝由单原丝和双丝类型组成，并且鉴定出CBD折叠由4R tau中的K274-E380组成 ，在折叠内具有非蛋白质分子。据报道，在CBD病例中观察到的前缠结显示出与AD病例不同的纤维形态，这可能是由于AD和CBD细丝的两条原丝之间的稳定性和相互作用存在差异。
PSP 折叠在结构上不同于CBD折叠，由4R tau中的G272-N381组成，在典型和非典型 PSP病例中相同。在GGT的病例中，鉴定了由4R tau中的G272-R379组成的纤维状核心结构，类似于PSP折叠，虽然在PSP病例中仅发现了原丝型tau丝，但在三种类型的GGT的I型和II型病例中发现了由两种原丝堆积在不同界面上组成的多重结构。在AGD、FTDP-17T（内含子10 突变 3 和 16）和衰老相关tau星形胶质细胞病 (ARTAG) 病例中，纤维核心结构类似于CBD折叠，已确定由4R tau中的 G273-D387或N279-N381组成。在上述tau病变的纤维核心结构中和周围检测到疾病特异性PTMs。AD病例中K356处和PiD病例中S262处的非磷酸化可由以下事实来解释，即这些残基位于每个折叠中外部不可接近的位置，这表明在tau蛋白病中，这些残基的磷酸化可能折叠形成后发生。这些疾病特异性tau纤维核心结构以及这些结构在同一疾病组中的一致性提供了在患者大脑中tau菌株形成的直接证据。尽管尚未确定CTE折叠和CBD折叠内的非蛋白质分子，但这些分子可能分别导致与AD折叠和AGD/FTDP-17T/ARTAG折叠的结构差异。在肝素和硫酸葡聚糖等聚阴离子存在的情况下，从大肠杆菌中纯化的重组tau还会形成类似于患者来源的tau丝的淀粉样蛋白丝。通过低温EM 对这些合成tau丝进行的结构分析揭示了一种来自合成2N3R tau丝的纤维芯结构和四种来自合成2N4R tau丝的纤维芯结构。然而，这些纤维核心结构与任何源自患者大脑的结构都不一致。这种差异可能归因于聚阴离子的影响，聚阴离子对于合成tau丝的形成至关重要。另一方面，据报道，由tau I297-E391 组成的合成肽在没有聚阴离子的情况下形成类似PHF 的细丝。也有人提出，一些细胞衍生因子和辅助因子会影响tau丝的形成，并且 CTE折叠和CBD折叠中的非蛋白质分子可能源自神经胶质细胞环境。
表1 患者来源的致病性 tau、α-syn 和 TDP-43 的结构和生化特征总结
与tau丝的结构多样性一致，从患者大脑中提取的肌氨酰不溶部分通过免疫印迹方法，在生化特征上显示的异常tau条带模式表征了tau病变。在AD病例中，全长tau的六种同种型分别为60、64和68kDa条带，在PiD病例中，全长3R tau的三种同种型分别为60和64kDa条带（图1h）。在4R tau病变中，包括PSP、CBD、FTDP-17T（ 14 和 16）、GGT和AGD病例，检测到三种全长4R tau同工型分别为64和68kDa条带（图 1h）。由识别tau的C末端的抗体检测到的Tau C末端片段 (CTF)也是tau病变的特征。在AD病例中检测到19、22、25、30、36和40 kDa的CTF，在PiD病例中检测到21、34和39kDa（图 1h）。在CTE病例中报告了类似于AD病例的CTF。在PSP和CBD情况下，分别检测到22、33kDa和22、37 双峰、43kDa的不同CTF（图1h）。这些CTF条带模式在同一疾病组中很常见。其他4R tau蛋白病的CTF型可分为PSP型和CBD型。从GGT病例中提取的不溶性tau的CTF为PSP型，而从FTDP-17T ( 14 16) 和AGD病例中提取的不溶性tau的CTF为CBD型（图1h）。这些疾病特异性CTF条带模式可能是由于长丝形成后全长tau加工的差异，也反映了tau丝结构特征的相似性，如上述冷冻电镜结构分析所示。PSP和GGT折叠显示出相似的三层结构，而CBD和AGD/FTDP-17T折叠显示出相似的四层结构（表1）。来自患者大脑的经胰蛋白酶处理的不溶性tau 也显示出每种tau病变特有的胰蛋白酶抗性条带。这些胰蛋白酶处理的不溶性tau的质量分析揭示了疾病特异性胰蛋白酶抗性核心序列。这些序列与冷冻电镜分析揭示的纤维核心结构的序列相匹配。
患者来源的tau菌株的实验性朊病毒样扩增和传播
从患者大脑中提取的不溶性tau在体外、培养细胞、原代培养和动物大脑中充当种子，并诱导种子依赖性tau聚集。在蛋白质错误折叠循环扩增 (PMCA) 和实时震颤诱导转化(RT-QuIC)等体外系统中，将从大肠杆菌中纯化的重组tau和来自tau 病患者的样本与配体硫代黄素混合并孵育通过摇动或超声处理，特异性结合β-折叠结构。据硫代黄素荧光强度监测种子依赖性tau聚集。据报道，使用脑匀浆的RT-QuIC可以根据与硫黄素T的反应性将AD和CTE病例与PiD病例区分开来。同样，来自PSP和CBD病例的脑匀浆和脑脊液可以通过RT-QuIC进行诊断。此外，将患者来源的tau种子引入表达tau的培养细胞或原代培养物中会诱导细胞内tau聚集。从AD病例(AD-tau)中提取的不溶性tau会招募3R tau和4R tau进行聚集，而从PiD病例(PiD-tau)或4Rtau病病例中提取的不溶性tau会分别导致仅3R tau或 4R tau的聚集。此外，据报道，将患者来源的tau种子引入荧光共振能量转移生物传感器细胞会诱导形成具有各种形态的tau聚集体 并且这些形态差异在细胞传代过程中遗传。将患者来源的tau种子接种到小鼠大脑中也会导致与接种样品相关的tau病理形成。源自AD、PSP、CBD和AGD病例的脑匀浆在人tau转基因(Tg)小鼠脑中诱导了与接种样品相关的tau病理学，而源自PiD 病例的脑匀浆不会诱导类似皮克体的tau病理学。在用从tau 病变病例中提取的脑匀浆或不溶性部分接种野生型小鼠后，还观察到与接种样品相关的Tau病变，包括细胞类型特异性。此外，据报道，在表达人类tau的所有六种亚型的小鼠中会形成与疾病相关的tau病理。AD-tau诱导的tau病理涉及所有tau异构体，而PiD-tau和从PSP病例(PSP-tau)和 CBD病例(CBD-tau)中提取的不溶性tau分别诱导仅由3R tau或4R tau组成的tau病理。这些结果表明，在tau病变患者的大脑中积累的tau细丝的构象与每种疾病的tau病变的形成有关。
人源突触核蛋白病的致病性α-突触核蛋白的超微结构和生化分类
α-突触核蛋白是一种突触蛋白，在大脑中含量丰富，定位于突触前末端。它由三个结构域中的140个氨基酸组成，N末端结构域、称为NAC（非淀粉样蛋白核心）的疏水区域和C末端富含脯氨酸的疏水区域。在生理条件下，α-突触核蛋白是一种水溶性的、天然未折叠的蛋白质，其功能尚不清楚。然而，α-突触核蛋白基因敲除小鼠的表型表明，α-突触核蛋白可能参与多巴胺的释放。突触核蛋白病分为两大类，路易体病 (LBD)，其特征在于神经元中的α-突触核蛋白包涵体，以及MSA，其特征在于主要在少突胶质细胞中的α-突触核蛋白包涵体。在包括 PD、帕金森病伴痴呆 (PDD) 和 DLB 在内的LBD中，α-syn在神经元细胞体和神经突中以路易体（LB）和路易神经突 (LN) 的形式积聚（图 2a)。在LBD病例的神经元细胞中观察到弥漫性α-突触核蛋白-免疫阳性沉积物和具有纤维结构的苍白小体，表明它们是在LB形成的初步阶段形成的。除了Braak分期，McKeith分期也被广泛用作LBD的神经病理学分期系统。Braak分期评估路易病理学的扩展，而McKeith型根据解剖区域LB病理学的严重程度将LBD分为五种神经病理学亚型。MSA分为以帕金森病为主的MSA (MSA-P) 和以小脑共济失调为主的MSA (MSA-C)，在这两种情况下，α-突触核蛋白作为GCI在少突胶质细胞中积累（图2b)。突触核蛋白病患者大脑中积累的异常α-syn在S129处被磷酸化，并且部分泛素化。过90% 的α-突触核蛋白在DLB患者的大脑中被磷酸化，而在健康大脑中只有4% 被磷酸化。在LBD患者中，不仅在大脑中检测到磷酸化的α-突触核蛋白病理学，而且在食道、心脏、皮肤、肾上腺、肠道和交感神经节等外周组织中也检测到。α-突触核蛋白在各种外周组织中表达，以及α-突触核蛋白病理从外周组织扩散到中枢神经系统也被提出。此外，据报道，突触核蛋白病患者的脑脊液和血液中α-突触核蛋白的浓度增加，这一发现有望为早期诊断提供一种实用的方法。然而，由于α-突触核蛋白大量存在于血小板中，因此诊断需要通过仔细的血液样本检测。据报道，编码 α-突触核蛋白的SNCA基因中的九个错义突变（A30P、A30G、E46K、H50Q、G51D、A53T、A53E、A53V和E83Q）会导致家族性突触核蛋白病。实验发现，与野生型相比，这些突变在细胞毒性、与细胞膜和脂质的关联以及细丝形成方面表现出差异。SNCA基因的复制和三倍复制也会导致早发性LBD。有人提出PrPC和淋巴细胞激活基因3(LAG3)与α-突触核蛋白丝结合并作为受体参与致病性α-突触核蛋白的细胞间传递，但这仍然存在争议，有几份报告表明PrPC与α-突触核蛋白不结合和人类神经元中缺乏LAG3 表达。
图2 从人类突触核蛋白病中提取的致病性α-突触蛋白的超微结构和生化特征
在突触核蛋白病患者的大脑中，异常的 α-突触核蛋白以淀粉样蛋白样纤维结构的形式积聚。LBD大脑中的纤维结构在1960年首次被报道。从突触核蛋白病患者的大脑中提取的肌氨酰不溶性部分的电子显微镜显示直径为5-10nm的α-突触核蛋白细丝，并且来自LBD和MSA病例的α-突触核蛋白细丝之间存在结构差异（图2c）。从LBD案例中提取的α-突触核蛋白细丝是直的，而从 MSA 案例中提取的那些以80-100nm的周期性扭曲（图2c）。已通过低温EM分析确定包括MSA-C和MSA-P的MSA 病例的α-突触核蛋白丝的核心结构。已鉴定出两种类型的α-突触核蛋白细丝，即I型和II型。I 型丝由两条原丝组成，PF-IA由G14-F94组成，PF-IB由K21-Q99组成，而II型丝由两条原丝组成，PF-IIA由G14-F94组成，PF-IIB由G36-Q99组成（表1）。此外，在I型和II型中都可以看到两条原丝之间的额外密度，而不是由于α-突触核蛋白（表1）。尽管这些推定的非蛋白质分子的细节仍不清楚，但表明它们参与了两条原丝的组装。二维分析表明，与从MSA病例中提取的那些不同，从DLB病例中提取的α-突触核蛋白丝没有扭曲。野生型和家族性突触核蛋白病相关突变型合成α-syn丝的核心结构也有报道。与合成tau丝的情况一样，合成α-突触核蛋白丝的结构与MSA病例中鉴定的I型和II型丝的结构都不一致。通过免疫印迹检测到突触核蛋白病患者大脑中积累的异常α-突触核蛋白为17kDa条带（图 2d）。LBD和MSA中α-突触核蛋白抗体检测到的高分子量条带不同：LBD中检测到22、29和37kDa条带，而MSA中检测到22和32kDa条带（图 2d）。据报道，在DLB中观察到的三个高分子量条带中的每一个都是泛素化的α-突触核蛋白，这表明异常α-突触核蛋白的PTM模式在LBD和MSA中是不同的。从LBD和MSA病例中提取的不溶性α-突触核蛋白对蛋白酶的敏感性和蛋白酶抗性条带模式也不同。从 MSA 病例中提取的不溶性α-突触核蛋白(MSA-syn) 比从LBD病例中提取的不溶性α-突触核蛋白（LBD-syn) 对蛋白酶K和链霉蛋白酶的抵抗力更强。此外，MSA-syn具有高SDS溶解度，而LBD-syn显示低SDS溶解度。
患者来源的 α-突触核蛋白菌株的实验性朊病毒样扩增和传播
与tau 一样，从突触核蛋白病患者大脑中提取的不溶性α-突触核蛋白表现出类似朊病毒的特性，并在体外和体内引起种子依赖性α-突触核蛋白聚集。朊病毒样播种活性的异质性也有报道，这取决于α-突触核蛋白菌株。与tau蛋白病的情况类似，来自突触核蛋白病患者的脑、脑脊液和皮肤样本中的异常α-突触核蛋白已被证明可通过PMCA和RT-QuIC方法特异性检测，并且是突触核蛋白病早期阶段有用的生物标志物。使用源自突触核蛋白病病例的脑样本和CSF的PMCA分析揭示了源自PD病例(PD-syn)和MSA-syn的α-突触核蛋白的播种活性存在差异。与PD-syn相比，MSA-syn 诱导硫黄素荧光强度快速增加，而添加PD-syn时的平台期荧光值远高于添加 MSA-syn 时的荧光值。平台期荧光值的变化可能反映了PD-syn 和MSA-syn在α-突触核蛋白丝与硫黄素的结合模式方面的结构差异。通过PMCA方法检测到的PD病例中扩增的α-突触核蛋白聚集体在蛋白酶K处理后显示4个4-10kDa的条带，而在源自MSA病例的α-突触核蛋白聚集体的情况下仅检测到2个 4和6kDa的条带。这两种类型的蛋白酶K抗性条带模式表明根据模板形成不同PMCA产物。在培养细胞和原代培养物中也观察到LBD-syn和MSA-syn之间接种活性的差异（即MSA-syn比LBD-syn诱导更大的细胞内α-突触核蛋白聚集）。此外，在α-突触核蛋白A53T Tg小鼠和野生型小鼠的大脑中表现出MSA-syn的强效朊病毒样特征。然而，在接种MSA-syn的小鼠大脑中，在神经元中观察到α-突触核蛋白病理，但在少突胶质细胞中没有观察到。这可以通过少突胶质细胞中α-突触核蛋白的表达水平来解释。健康大脑和MSA大脑的原位杂交分析表明，α-突触核蛋白在少突胶质细胞中的表达非常低。在形成β-折叠结构之前，正常或寡聚的α-syn可能从神经元分泌并掺入少突胶质细胞中。少突胶质细胞中的α-突触核蛋白病理学已证明在少突胶质细胞中表达α-突触核蛋白的Tg小鼠中形成。需要进一步的研究来阐明神经元衍生的α-突触核蛋白在MSA中GCI形成中的作用。此外，少突胶质细胞与神经元不同的细胞环境可能会影响α-突触核蛋白细丝的形成，从而导致α-突触核蛋白菌株的产生。基于使用重组α-突触核蛋白的研究，已经提出了不同细胞环境可能参与不同α-突触核蛋白菌株形成的可能性。在各种生理条件下形成的合成α-突触核蛋白丝表现出不同的形态和物理特性，并在体外、培养细胞和原代培养物中表现出不同的播种活性、细胞毒性和蛋白酶体活性。在生理盐浓度存在下形成的合成α-突触核蛋白丝表现出显著的细胞毒性，而在没有盐的情况下形成的那些在大鼠脑中表现出高播种活性 这些合成的α-突触核蛋白菌株的脑内接种还会在α-突触核蛋白A53T Tg小鼠和野生型小鼠的大脑中引起各种α-突触核蛋白病理形态和传播模式。
人源TDP-43蛋白病的致病性TDP-43的超微结构和生化分类
TDP-43是一种主要位于细胞核中的RNA结合核蛋白。它由411个具有核转位信号(NLS) 序列的氨基酸组成，由N端结构域、两个RNA识别基序结构域和 C 端富含甘氨酸结构域组成 。TDP-43的生理功能包括调节前体mRNA剪接等加工功能，还参与了mRNA 从细胞核到细胞质的运输。据报道，TDP-43是在FTLD和 ALS患者的大脑中观察到的泛素阳性包涵体的主要成分。异常的TDP-43包涵体大多积聚在细胞质中，TDP-43的核定位及其生理功能均丧失。在FTLD-TDP中，磷酸化和泛素化TDP-43积累，根据病理学和分布的差异分为五种亚型（AE 型）。A型由神经元胞质包涵体 (NCIs) 和短营养不良神经突 (DN)定义（图 3a）。B型，包括伴有运动神经元疾病的ALS和FTLD，主要表现为NCI病理学（图 3b）。C型的特点是长DN（图 3c）。D型主要表现为核内包涵体病理学。E型的特点是粒丝状神经元包涵体和非常细的点状神经纤维包涵体。在FTLD-TDP患者的大脑中观察到TDP-43免疫阳性的弥漫性或颗粒状或短划线样细胞质包涵体，这些前包涵体的形成可能代表TDP-43蛋白病发病机制的早期阶段。边缘优势以及年龄相关性TDP-43脑病(LATE) 的神经病理学特征是磷酸化TDP-43在边缘系统中的积累，并导致老年人出现AD样症状。编码TDP-43的TARDBP基因上的错义突变与 ALS和FTLD-TDP的发病有关。已报道的突变超过30种，其中大部分位于C端低复杂度结构域。其他RNA结合蛋白的突变，包括hnRNPA1、hnPA2B1和 MATR3，以及C9ORF72基因中的六核苷酸重复扩增也会导致TDP-43蛋白病，这表明这些RNA结合蛋白与TDP-43的相互作用和RNA代谢稳态的破坏参与TDP-43的细胞质内积累。最近，已经研究了应激颗粒的形成与TDP-43在细胞质中的积累之间的关联。在各种应激条件下，如氧化应激和热休克，应激颗粒是由RNA和RNA结合蛋白组成的无膜细胞器，通过液-液相分离形成，据报道它们吸收内源TDP-43。然而，尚不清楚应激颗粒的形成是否直接导致TDP-43发病，这需要进一步研究。
图3 从人TDP-43蛋白病中提取的致病性TDP-43的超微结构和生化特征
对具有泛素阳性包涵体的ALS和FTLD病例的脑切片进行免疫电子显微镜研究表明，神经元中存在TDP-43和直径为10-20nm的泛素阳性直丝束。从TDP-43蛋白病患者的大脑中提取的不溶性部分的电子显微镜也观察到直径10-15nm的淀粉样细丝（图3d）。来自AC型的TDP-43细丝的超微结构特征对于每个亚型都是不同的，来自B型的TDP-43细丝比来自其他亚型的细丝更细（图 3d）。据报道，TDP-43的合成肽G274-F313和G314-N353在体外形成细丝，这些细丝具有播种活性，可招募在培养细胞中表达的野生型TDP-43或缺乏NLS的TDP-43用于聚集，这表明残基274–353对于TDP-43细丝的形成很重要。此外，对由SegA（残基311-360）和 SegB（残基286-331，包括ALS遗传突变A315E）肽形成的TDP-43细丝的低温EM分析，揭示了来自SegA细丝的三种不同的匕首形核心结构和一个由SegB细丝的四个R形折叠组成的核心结构。此外，已从TDP-43细丝中鉴定出由F276-M414 组成的纤维核心结构，该细丝由在弱酸性条件(pH4)下形成的低复杂度域 (残基267–414) 组成。对从两个被诊断为患有FTLD的 ALS个体提取的TDP-43细丝进行冷冻电镜分析，发现由G282-Q360组成的双螺旋形折叠，这与上述三种合成TDP-43细丝的纤维核心结构不同(表1)。从具有其他FTLD-TDP亚型的患者的大脑中提取的TDP-43细丝的结构也应该适合低温EM分析。从TDP-43蛋白病患者的大脑中提取的肌氨酰不溶性组分用磷酸化S409/S410抗体进行免疫印迹显示45kDa的磷酸化全长TDP-43条带和亚型特异性CTF条带（图 3e)。在A型中，存在23、24和 26kDa的主要条带和18和19kDa 的次要条带，其中23kDa条带最强（图3e）。类似地，在B型中可以看到18、19、23、24和26kDa的CTF，在24 kDa处具有最强的条带（图3e)。在C型中，可见23和24kDa的主要条带，其中23kDa条带更强烈，可见18和19kDa的次要条带（图 3e）。这些 CTF的条带模式在同一亚型组中很常见，并且可能反映了亚型之间全长TDP-43的N端截断的差异。即使在从一个个体的不同脑区和脊髓提取的不溶性组分中也检测到单一的CTF条带模式。据报道，患者来源的不溶性 TDP-43的蛋白酶抗性条带模式在同种亚型组是相同的，但在不同亚型之间是不同。此外，在从ALS病例中提取的不溶性组分中检测到的主要PTM是磷酸化、氧化和脱酰胺，并且还检测到部分泛素化。这些PTM主要位于C端域。虽然S403/S404和S409/S410的磷酸化是所有亚型的明确病理标志物，但已报道了对S369磷酸化的免疫反应性差异：B型和C型的TDP-43病理学是pS369阳性，而A型是pS369阴性。与tau和α-突触核蛋白一样，这些超微结构和生化变化可能反映了大脑中积累的异常TDP-43构象的差异，这表明在TDP-43蛋白病中形成了TDP-43菌株。在其他亚型和晚期积累的致病性TDP-43 的超微结构和生化特征需要进一步研究。
患者来源的TDP-43菌株的实验性朊病毒样扩增和传播
患者来源的不溶性TDP-43在体外和体内都表现出类似朊病毒的特性。一项 RT-QuIC 研究发现，源自ALS和FTLD病例的脑匀浆和脑脊液中的异常TDP-43使用从大肠杆菌中纯化的全长TDP-43和截短的TDP-43（残基263-414）作为底物进行扩增。TDP-43异常可作为早期诊断的生物标志物。将从 FTLD-TDP AC型患者的大脑中提取的不溶性TDP-43引入表达野生型TDP-43或缺乏NLS的TDP-43 的培养细胞中，导致磷酸化TDP-43的种子依赖性积累。此外，从已引入患者来源的TDP-43种子的细胞中提取的不溶性部分显示出与患者来源的原始种子相似的CTF条带模式。Sarkospin从FTLD-TDP型AC病例中提取的不溶性TDP-43在培养细胞中也显示出不同亚型的细胞毒性和接种活性存在差异。此外，据报道，从 ALS病例中提取的不溶性TDP-43诱导形成具有各种形态的磷酸化TDP-43包涵体，正如在ALS患者的大脑中在表达野生型TDP-43的培养细胞中观察到的那样，并且在培养细胞中积累的不溶性TDP-43的朊病毒样特性在细胞传代后遗传。在体内，将从患有散发性FTLD-TDP和具有GRN或C9ORF72基因突变的家族性FTLD-TDP患者的大脑中提取的不溶性部分脑内接种到在细胞质中表达人源TDP-43的Tg小鼠中，以时间依赖的方式再现了与接种样品相关的TDP-43病理学。将这些源自患者的样本接种到野生型小鼠中也诱导了TDP-43病理学，尽管病理学不如接种到 Tg小鼠中的情况那么丰富。
如何在患者的大脑中维持每种疾病的特征结构和生化特性？
正如我们所描述的，在患者大脑中积累的异常蛋白质表现出每种疾病特有的超微结构和生化特性。值得强调的是，这些特性在同一疾病组中很常见，甚至在一个人的不同大脑区域中也很常见。这些结果表明，致病性tau、α-突触核蛋白和 TDP-43在整个大脑中扩散，保留了它们的疾病特异性结构和生化特性。
为了进一步探索这种可能性，我们检查了疾病特异性tau聚集和细丝形成是否在培养细胞中重现。从tau病变患者的大脑中提取的不溶性tau被引入表达全长3R tau或4R tau的SH-SY5Y细胞中。PiD-tau仅诱导3R tau聚集，而PSP-tau和 CBD-tau仅诱导4R tau聚集。AD-tau招募了3R tau和4R tau进行聚合。在表达3R tau和4R tau的细胞中也观察到这种菌株特异性tau聚集。此外，在SH-SY5Y 细胞中积累的不溶性tau的免疫电镜显示，大量的tau丝被细胞中表达的标签蛋白的抗体标记，其结构类似于来源于患者大脑的细丝。这种在培养细胞中观察到的 tau丝的模板依赖性扩增可以用从大脑中提取的tau丝的核心结构来解释（图 4）。另一方面，PiD折叠、PSP折叠和CBD折叠包含3R tau或4R tau特异性序列，因此，当模板和底物之间存在错配时，不会促进β-折叠结构的聚合（图 4）。换句话说，tau丝的结构决定了哪种tau异构体被招募用于种子依赖性聚集，并且是 tau病理在大脑中形成和传播的决定因素。胰蛋白酶处理的患者来源的tau种子在tau纤维核心区域（绒毛外层）外消化，导致与未处理的tau种子相同的种子依赖性聚集，这支持纤维核心区域在tau细丝扩增中起主要作用的观点。因此，我们的结果表明，大脑中特征性蛋白质的模板依赖性扩增导致同一蛋白质病的病理多样性。
图4 模板和底物之间氨基酸序列的完全匹配对于 tau 火焰的模板依赖性扩增至关重要
通过体外和体内观察由物种障碍引起的低播种和繁殖效率也清楚地证明对模板依赖性扩增的模板和底物之间氨基酸序列同一性的要求。人和小鼠α-突触核蛋白的氨基酸序列有140个氨基酸中的7个残基不同，据报道，当底物和模板来自不同物种时，播种活性显著降低。这可能是由于模板和底物之间的不匹配导致的结构不稳定性。尽管产生不同菌株的机制仍不清楚，但不同的折叠（模板）是由正常蛋白质形成的，这取决于遗传和/或环境因素（图 5a）。然后，在存在与模板（和辅因子）匹配的底物的情况下，相同折叠组成的细丝开始形成并扩增（图5a）。疾病相关的错义突变直接影响纤维核心结构并产生不同的菌株。与家族性突触核蛋白病相关的突变合成α- 突触核蛋白丝的结构分析表明，这些突变不仅影响核心结构，而且影响两个原丝之间的界面。作为环境因素，最初发生聚集的大脑区域和细胞类型（神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞）可能对菌株形成有很大贡献。实验表明，即使在不同细胞环境的扩增过程中，患者来源的致病蛋白也能保持其特性。tau病变中3R 或4R tau特异性菌株的形成可能是由tau异构体的异质表达引起的，具体取决于大脑区域和细胞类型。在MSA病例中，少突胶质细胞特异性微管蛋白聚合促进蛋白p25α在α- 突触核蛋白积累之前错误定位于细胞体，并且有人提出p25α可能有助于MSA特异性菌株的形成。每种细胞类型老化过程的差异也可能是一个因素。此外，细胞类型特异性或非特异性辅因子可能直接导致疾病特异性折叠的形成。CTE和CBD折叠内的潜在辅助因子包括脂质和聚阴离子，实验发现它们会影响细丝的形成。结构和质量分析相结合支持PTM参与菌株形成，这表明K340处的泛素化是单线型CBD细丝的特征，可防止双线形成。正如实验所证明的，与朊病毒样蛋白质、盐浓度、pH 值和金属相互作用的其他蛋白质、脂质和核酸也是导致各种形式的错误折叠的环境因素。一旦细丝在细胞中积聚，破碎的致病种子就会被释放到细胞外空间并被相邻的健康细胞吸收。虽然细胞间传播的机制尚不完全清楚，但致病种子可能通过胞吐作用或由膜囊泡介导的转运释放，包括突触小泡和外泌体（图 5b）。从死细胞中泄漏病原种子也是可行的。然后，细胞外致病种子可以直接被吸收到细胞中，或者通过大胞饮作用、受体介导的内吞作用或外泌体的膜融合（图 5b)。最近，还证明致病种子可以通过隧道纳米管在神经元细胞之间传播（图 5b）。这些致病蛋白沿着神经元回路的连续细胞间传递导致脑内病理扩展。在脑中致病蛋白的扩增和扩散过程中，疾病特异性折叠得以维持，从而导致临床和病理多样性。尽管冷冻电镜分析揭示了使用突触核蛋白病患者的脑和脑脊液样本进行体外试验扩增的α-突触核蛋白细丝结构，但这些结构与从患者脑中提取的 α-突触核蛋白细丝的结构并不相同。因此，细胞环境和辅助因子可能在菌株形成中起关键作用。
图5 神经退行性疾病中的菌株形成和细胞间传递
小 结
患者大脑中积累的异常蛋白质的异质性是神经退行性疾病发病和进展的关键因素。死后大脑的结构和生化分析揭示了致病蛋白的结构多态性（菌株）和朊病毒样特性。值得注意的是，最近对从患者大脑中提取的 tau 和α-突触核蛋白丝致病蛋白的详细结构信息将有助于开发针对蛋白质聚集和细胞间传播的疾病调节剂。疾病特异性纤维核心结构的差异也可能表明每种疾病需要不同的方法。同样的情况将适用于用来早期诊断的 PET 配体，这可能会导致 PET 配体的发展，该配体可以区分同一蛋白质病中的每种疾病。阐明菌株形成的机制以及相关因素对于更好地了解神经退行性疾病中的致病蛋白菌株至关重要。定义每种疾病的成熟细丝应该在成熟过程中通过几种不同的形态形式。重要的是要阐明疾病特异性折叠是在初始原纤维物种形成时还是在成熟过程中的某个其他时间点建立的，以阐明菌株形成的机制和表征从前缠结/前夹杂物到纤维状夹杂物的过渡。多种致病蛋白的相互作用促成发病机制的方式以及相互作用的菌株特异性特征需要进一步研究。既然已经提出了细胞环境在菌株形成中的重要性，了解具有聚集体的细胞的细胞动力学变化将有助于阐明聚集、细胞间传递和神经退行性变的机制，以及菌株形成机制。
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Airi Tarutani Tadashi Adachi Hiroyasu Akatsu Yoshio Hashizume Kazuko Hasegawa Yuko Saito Andrew C Robinson David M A Mann Mari Yoshida Shigeo Murayama Masato Hasegawa. Ultrastructural and biochemical classification of pathogenic tau α-synuclein and TDP-43. Acta Neuropathol. 2022 Jun; 143(6):613-640. doi: 10.1007/s00401-022-02426-3.
编 译 / 吴小恋
校 审 / 蔡玉洁
