细胞培养纯化技术（清华大学杜亚楠）

细胞培养纯化技术（清华大学杜亚楠）研究思路这项研究刊登在Biomaterials（生物材料）杂志上，题目如下：“Engineered meatballs via scalable skeletal muscle cell expansion and modular micro-tissue assembly using porous gelatin micro-carriers（多孔明胶微载体大规模扩增肌肉细胞及模块化生物组装的人造肉球技术）”。-01 -从细胞规模化培养到人造肉丸2022年5月30日，清华大学医学院杜亚楠教授课题组报道了一项研究成果， 在可食用的多孔明胶微型生物支架（微载体）上，肌肉和脂肪祖细胞可快速扩增并分化成熟；进一步利用生物组装技术，可将肌肉和脂肪微组织原料聚合成数厘米大小的人造肉丸。

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细胞培养肉技术是近十年来细胞生物学和组织工程等学科交叉的新领域。以动物肌肉细胞为来源的培养肉，旨在解决传统畜牧业空间和能源耗费巨大、不环保的弊端。

细胞培养肉技术的难点在于：第一，如何在体外大规模扩增骨骼肌细胞和脂肪祖细胞，并诱导其朝着成熟细胞的方向高效分化；第二，如何运用组织工程学技术，创造出微观结构上高度仿生的人造肌肉组织。

目前通过二维平面培养获得的细胞肉的产量还很低，成本较高，还不足以形成大体积的肌肉组织作为食品出售。因此，开发高效、安全、低成本的动物细胞培养技术，构建动物身上的肌肉组织生长环境，并在生物反应器中实现大规模的生产，将成为细胞肉产业化生产的关键问题。

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从细胞规模化培养到人造肉丸

2022年5月30日，清华大学医学院杜亚楠教授课题组报道了一项研究成果， 在可食用的多孔明胶微型生物支架（微载体）上，肌肉和脂肪祖细胞可快速扩增并分化成熟；进一步利用生物组装技术，可将肌肉和脂肪微组织原料聚合成数厘米大小的人造肉丸。

这项研究刊登在Biomaterials（生物材料）杂志上，题目如下：“Engineered meatballs via scalable skeletal muscle cell expansion and modular micro-tissue assembly using porous gelatin micro-carriers（多孔明胶微载体大规模扩增肌肉细胞及模块化生物组装的人造肉球技术）”。

研究思路

图1. 从细胞的规模化扩增到人造肉的组织工程学构建

1. 通过明胶微载体将猪肉骨骼肌干细胞增殖，并分化成成熟肌肉细胞

2. 将微载体和肌肉细胞，通过3D打印技术制成肉糜。同时，鉴定组成成分比例。

3. 换成小鼠骨骼肌干细胞，继续重复人造肉实验。

4. 通过本培养体系扩增小鼠脂肪祖细胞，与骨骼肌细胞混合，制得“肥瘦相间”的细胞培养肉，鉴定组成成分比例

猪肉干细胞的增殖和分化

图2. 猪骨骼肌干细胞的分化

多孔明胶微载体（采用华龛生物3D FloTrix®）是一种优秀的细胞3D培养微型支架。在搅拌式生物反应器中，生长在多孔明胶微载体上的猪原代肌肉星形细胞（即猪骨骼肌干细胞）和C2C12小鼠成肌细胞，7天内可高效扩增至20倍。同时，微载体的立体多孔结构，比传统的2D细胞培养瓶更加节省培养基的用量，从而降低了人造肉丸的成本。

有趣的是，在无需添加传统的肌肉分化诱导成分（如马血清）的培养条件下，骨骼肌干细胞会自发地朝着成熟肌肉细胞方向进行分化，并合成肌球蛋白重链（该蛋白的表达标志着肌肉细胞的分化和成熟）。由图中可看到，在分化过程中表达的相关基因和蛋白标志物均有显著提高。

人造猪肉丸

图3. 细胞培养猪肉制品在烹饪之前（a，c）和之后（b d）的形态，以及与天然猪肉制作的食用猪肉丸（狮子头）的硬度(e)和营养成分(f)对比

此外，取培养7-10天的细胞-微载体复合的“微组织”，加入谷氨酰胺转氨酶作为组织交联剂，利用3D打印模具，将几百mm的微组织打印成cm大小的肉糜类似物（比如猪肉丸子和猪肉切片）。

同时，研究者分析了肉丸的营养成分，蛋白质占比69.8%，脂肪4%，碳水化合物6%，以及其它重要的必需矿物质如锌、钙、铁等。与购买的传统肉类制作的“狮子头”对比，人造肉含有更高的蛋白质含量和更低的脂肪。因此，从营养健康的角度讲，人造肉能够成为很好的肉糜产品的替代品。

小鼠脂肪祖细胞的增殖和分化

图4. 猪骨骼肌干细胞的分化

为了研究这种可食用的多孔微型载体是否适合其它种类骨骼肌细胞的扩增培养，我们还选取了小鼠成肌细胞系C2C12在微载体体系下进行动态悬浮培养。结果表明，与猪肌肉干细胞类似，C2C12在3D TableTrix®微载体培养体系中不仅能大量高效增殖（7天扩增21倍），而且也同样不需要添加诱导分化物质即可自发形成成熟的骨骼肌细胞。

“肥瘦相间”的人造肉

3D微载体封装的MSC-Ex-4 体内功能实验

不仅如此，3D FloTrix®微载体培养体系同样也支持小鼠脂肪前体细胞3T3L1的扩增和分化。将分化后的脂肪微组织按一定比例与肌肉细胞微组织进行混合，然后利用3D模块化生物打印技术，还可得到“肥瘦相间”的人造肉丸，并且这种肉丸的脂肪比例是可调的。

我们可畅想未来应用这项细胞肉培养技术可实现根据不同人群的喜好和需求来进行肉类产品的定制。

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文末小结

综上，本研究显示，利用可食用的多孔明胶微载体，结合搅拌式生物反应器，可在体外高效、规模化扩增肌肉和脂肪祖细胞，并诱导其分化和成熟。随后，将收获的成熟肌肉和脂肪微组织，在3D打印的肉丸模具中，以一定比例组装成“肥瘦相间”的人造肉丸。该技术可服务于肉糜型细胞培养肉和肌肉再生等多种组织工程应用场景。

清华大学医学院杜亚楠教授为该文章的通讯作者，清华大学医学院博士后刘烨为论文的第一作者。

文中应用的多孔明胶微载体和搅拌式生物反应器基于北京华龛生物科技有限公司相关商业化产品；

猪原代肌肉星形细胞来自南京农业大学丁世杰副教授的赠与。

该研究得到了国家杰出青年科学基金（82125018） 中国博士后科学基金站前特别资助（043220062）的支持。

▉ 研究团队介绍

本项研究由清华大学与北京华龛生物科技有限公司共同合作完成。研究中应用的多孔明胶微载体和搅拌式生物反应器等相关配套材料及设备，均来自于华龛生物的成熟商业化产品。

▉ 关于清华大学医学院-杜亚楠教授：

杜亚楠教授在“微组织工程”交叉研究方向进行创新探索，实现理论探究和技术转化。他开发的3D微组织技术可作为新一代细胞药物的扩增制备平台和药剂学递送系统，革新体外细胞培养和再生医学；同时可辅助建立仿生生理/病理模型，用于高通量药物筛选和病理机制研究。杜亚楠教授共发表高影响力SCI论文100 余篇 (发表在Nature Materials，Nature Communications PNAS，Science Advances等杂志)。批准授权专利 16 项，相关微组织工程技术专利技术于 2018 年成立北京华龛生物科技有限公司进行转化应用和商品化。

▉ 关于华龛生物：

北京华龛生物科技有限公司由清华大学医学院科研团队领衔、清华大学参股共建。专注于打造原创3D细胞“智造”平台，提供基于3D微载体的细胞规模化定制化扩增工艺整体解决方案，解决全球细胞产业发展痛点。

公司核心产品3D TableTrix®微载片（微载体），是自主创新型、首款可用于细胞药物开发的药用辅料级微载体。已通过中检院等相关权威机构的检验报告，并获得2项国家药监局药用辅料资质和美国FDA DMF药用辅料资质。

华龛生物的产品与服务，可广泛应用于基因与细胞治疗、细胞外囊泡、疫苗及蛋白产品等生产的上游工艺开发。同时，在再生医学、类器官与食品科技（细胞培养肉等）领域也具有广泛应用前景。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2022.121615

《自然 · 综述》：T细胞在衰老中的角色

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