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湖南大学柯国梁(湖南大学王柯敏课题组Anal.)

湖南大学柯国梁(湖南大学王柯敏课题组Anal.)图1. 用2%琼脂糖凝胶电泳验证apt-ADTNs的形成(图片来源:Anal. Chem.)自从1982年Seeman对DNA纳米结构的深入研究以来,DNA不仅是生命遗传密码的载体,而且还是可编程构建纳米结构的理想材料。近年来,DNA纳米技术的迅速发展为不同尺寸和形状的二维、三维DNA纳米结构的组装带来了诸多便利。在这些DNA纳米结构中,DNA四面体作为最简单、最经典的三维DNA纳米结构,可以通过四个单链DNA在一锅中通过热退火过程组装而成。DNA四面体作为一种独特的结构特征,可以很好地实现二元化学和生物分子的功能化,而且DNA四面体具有纳米级可控性、细胞毒性低、细胞通透性好、抗消化能力高等优点。因此DNA四面体在生物医学领域被广泛应用于生物分子检测、生物成像和癌症治疗。有鉴于此,作者选择在MCF-7细胞中过度表达的piRNA-36026作为模型靶点,设计了适配体功能化的可激活DNA四面体

湖南大学王柯敏课题组Anal. Chem.:适配体功能化激活的DNA四面体纳米探针用于肿瘤细胞中与PIWI蛋白相互作用RNA的成像与调控

与PIWI蛋白相互作用的RNA (piRNAs)在肿瘤的侵袭和转移、维持肿瘤的增殖信号等方面发挥着重要作用,可以作为一种新的生物标志物。湖南大学王柯敏教授课题组设计了适配体功能化激活的DNA四面体纳米探针(apt-ADTNs)来成像和调控癌细胞内的内源性piRNAs,在DNA四面体中加入了适配体AS1411和piRNA-36026与Cy5荧光染料的反序列,然后一个带有淬灭剂的短寡核苷酸(Q-oligo)与piRNA-36026互补连接,以淬灭Cy5的荧光。apt-ADTNs可以通过适配体AS1411识别MCF-7细胞,然后进入MCF-7细胞。由于apt-ADTNs与piRNA-36026结合,Q-oligo与apt-ADTNs分离,导致Cy5荧光信号恢复。同时,apt-ADTNs和piRNA-36026的杂交也导致了胞浆中游离piRNA-36026的下调和MCF-7细胞的凋亡。该研究成果在Anal. Chem. 上发表。(DOI:10.1021/acs.analchem.9b03819)

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piRNAs是一类24-32 nt的非编码核苷酸,与Argonaute蛋白的PIWI亚家族特异性相互作用。近日一些研究表明piRNAs的表达水平在多种癌症类型如乳腺癌、胃癌和泌尿系肿瘤中不正常,且piRNAs的表达失调与肿瘤细胞激活侵袭和转移、维持增殖信号有关。因此,可以认为piRNAs是一种潜在的癌症生物标志物,通过有效地检测和调控piRNAs,可以为癌症的诊断和治疗提供一种新的思路。

自从1982年Seeman对DNA纳米结构的深入研究以来,DNA不仅是生命遗传密码的载体,而且还是可编程构建纳米结构的理想材料。近年来,DNA纳米技术的迅速发展为不同尺寸和形状的二维、三维DNA纳米结构的组装带来了诸多便利。在这些DNA纳米结构中,DNA四面体作为最简单、最经典的三维DNA纳米结构,可以通过四个单链DNA在一锅中通过热退火过程组装而成。DNA四面体作为一种独特的结构特征,可以很好地实现二元化学和生物分子的功能化,而且DNA四面体具有纳米级可控性、细胞毒性低、细胞通透性好、抗消化能力高等优点。因此DNA四面体在生物医学领域被广泛应用于生物分子检测、生物成像和癌症治疗。

有鉴于此,作者选择在MCF-7细胞中过度表达的piRNA-36026作为模型靶点,设计了适配体功能化的可激活DNA四面体纳米探针(apt-ADTNs)对piRNA-36026进行成像和调控。首先,由四个寡核苷酸(S1、S2、S3和S4)构建DNA四面体框架,其中两个寡核苷酸附加适配体AS1411,而另两个寡核苷酸由piRNA-36026的反序列延伸,并在3′端修饰Cy5。下一步,5′端用BHQ2修饰的短寡核苷酸(Q-oligo)与piRNA-36026互补,导致Cy5荧光的高效淬灭。apt-ADTNs可通过适配体AS1411进入MCF-7细胞,与胞浆中游离的piRNA-36026杂交,随着Q-oligo的下降,Cy5荧光恢复。同时,apt-ADTNs和piRNA-36026的杂交导致piRNA-36026下调,并导致MCF-7细胞凋亡,这是由于piRNA-36026相关分子途径作为维持增殖信号和逃避生长抑制物的干扰。因此,apt-ADTNs不仅可以实现piRNA-36026的成像,而且可以在细胞质中实现piRNA-36026的调控。

作者采用两步法合成了apt-ADTNs。第一步是荧光DNA四面体骨架的自组装。将寡核苷酸S1、S2、S3和S4溶解并以等摩尔量混合在Tris-Mg buffer(10 mM Tris,5 mM MgCl2,pH 8.0)中。将混合物在95 ℃下加热5分钟,立即冷却至4 ℃下10分钟,并在4 ℃下杂交4小时。在下一步中,向混合物中添加Q-oligo以合成apt-ADTNs。采用琼脂糖凝胶电泳和AFM分析两种方法对apt-ADTNs进行了表征。2%琼脂糖凝胶电泳证实了apt-ADTNs的形成。如图1所示,通道1、通道2、通道3、通道4和通道5分别是S1、S1 S2、S1 S2 S3、S1 S2 S3 S4和S1 S2 S3 S4 Q-oligo(apt-ADTNs)。由于apt-ADTNs分子量大,通道5(apt-ADTNs)的迁移速度比其他通道慢。同时,利用RGB图形成像系统进行荧光淬灭实验,对结果进行分析,并用于apt-ADTNs组装的鉴定。用SYBR Gold(Ex=490 nm,Em=540 nm)染色用于琼脂糖凝胶电泳每个通道的荧光成像,通道1和通道2只有SYBR Gold(绿色)的荧光。由于S3和S4上Cy5的修改,通道3和通道4呈现橙色和深橙色。在与BHQ2修饰的Q-oligo的参与下,通道5没有显示出Cy5荧光(红色),这是因为其与Q-oligo杂交后Cy5荧光淬灭。结果表明,apt-ADTNs的形成是成功的。此外,AFM通过测量apt-ADTNs的高度来确定apt-ADTNs的形成。结果表明,apt-ADTNs在干燥状态下的高度约为3-4 nm。因此,琼脂糖凝胶电泳和AFM结果都证实了apt-ADTNs的成功制备。

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图1. 用2%琼脂糖凝胶电泳验证apt-ADTNs的形成(图片来源:Anal. Chem.)


为了探讨apt-ADTNs对靶标piRNA-36026的反应可行性,用完全匹配的piRNA-36026基因靶点监测apt-ADTNs的荧光恢复。在添加DNA靶点之前和之后测量Cy5的荧光信号。结果表明,Cy5的荧光强度增加了12倍左右。其次,对Cy5与BHQ2的比值进行优化,得到最佳信噪比(F/F0),在Cy5和BHQ2的1:1.5摩尔比下观察到最佳信噪比。此外,为了评估apt-ADTNs对DNA靶点的反应能力,还测量了apt-ADTNs对不同浓度靶点DNA的荧光强度。apt-ADTNs荧光的强度随DNA靶点浓度的增加而逐渐增强,表明apt-ADTNs的荧光恢复是由于apt-ADTNs与DNA靶点的结合所致。Cy5的荧光强度与0-10 nm范围内的DNA浓度成线性关系。结果表明,apt-ADTNs对piRNA-36026具有良好的应答能力。

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图2. 不同浓度DNA靶点处理apt-ADTNs(50nm)的荧光光谱以及不同浓度DNA靶点与信噪比的关系。(图片来源:Anal. Chem.)


为了验证apt-ADTNs识别适配体AS1411的可行性,选择apt-DTNs和ran-DTNs分别与MCF-7细胞孵育。通过流式细胞仪分析,与ran-DTN孵育的MCF-7细胞相比,与apt-DTN孵育的MCF-7细胞显示出更高的荧光强度,信噪比(F/F0)高达9.5。随后,作者还进行了共聚焦显微镜成像,以研究apt-ADTNs的识别能力。经apt-DTNs处理的MCF-7细胞上Cy5的荧光信号强于ran-DTNs。由于适配体AS1411和核仁蛋白的结合,apt-DTNs可以从细胞表面进入细胞,所以经apt-DTNs处理的MCF-7细胞从细胞膜到细胞质呈现明显的荧光信号。而在相同孵育时间内,用不含适配体AS1411的ran-DTN处理的MCF-7细胞几乎没有荧光。

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图3. 用apt-DTNs或ran-DTNs孵育MCF-7细胞后的流式细胞术分析以及分别与apt-DTNs和ran-DTNs孵育的MCF-7细胞的共焦显微镜成像(图片来源:Anal. Chem.)


在研究了apt-ADTNs的识别能力后,作者用apt-ADTNs对MCF-7细胞中的piRNA-36026进行了成像。将MCF-7细胞与apt-ADTNs孵育不同时间。共焦显微镜成像结果显示,MCF-7细胞中Cy5的荧光信号逐渐增强,最终随着孵育时间的增加接近平衡。为了研究apt-ADTNs在活细胞中对piRNA-36026的特异性显像,选择MCF-7细胞为阳性,MCF-10A、HepG-2和HeLa细胞为阴性对照,分别对piRNA-36026进行显像。在MCF-7细胞中观察到pi-RNA36026的Cy5荧光信号,而在MCF-10A、HepG-2和HeLa中几乎没有荧光信号。同时,作者用qRT-PCR方法检测piRNA-36026在MCF-7、MCF-10A、HepG-2和HeLa中的相对表达,piRNA-36026在MCF-7细胞中的相对表达水平远高于其他细胞。结果证实,Cy5荧光的激活是由于内源性piRNA-36026而非背景信号或核酸酶降解。

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图4. apt-ADTNs孵育4 h后不同细胞的共聚焦显微镜成像(图片来源:Anal. Chem.)


总结:

湖南大学王柯敏教授课题组开发了适配子功能化的可激活DNA四面体纳米探针(apt-ADTNs)用于乳腺癌piRNA-36026的成像和调控。apt-ADTNs是由五条DNA链自组装而成的,通过apt-ADTNs上的适配体而不是额外的化学基团来识别靶细胞。APT-ADTNs作为细胞内探针,具有细胞通透性好、细胞毒性低、抗酶降解能力强等优点,可以在MCF-7细胞中对piRNA-36026进行成像。同时,纳米探针上的调控序列(RS)可以通过与内源性piRNA-36026互补来调控piRNA-36026的游离水平,诱导MCF-7细胞凋亡。

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