光遗传学缺点（光遗传学工具再升级）

光遗传学缺点（光遗传学工具再升级）经过验证，eOPN3蛋白的吸收光为512nm，且在哺乳动物神经元中有良好的耐受性，也不会导致神经元兴奋性的显着光依赖性生理变化（图1）。进一步地对OPN3进行改造，将ER转运信号（ER）与高尔基体运输信号（ts）一起添加到OPN3，产生增强的OPN3-ts-mScarlet-ER（eOPN3），可在培养的海马神经元中提高总体表达并增强膜靶向性。在脊椎动物和无脊椎动物中，双稳态II型视紫红质含量很高，且其光漂白作用很低。许多已知的脊椎动物视紫红质都能够通过Gi/o途径偶联，然而它们在G蛋白解离后作为其自然光转导周期的一部分经历了光漂白。通过对数种双稳态视紫红质变体进行测试，特别针对它们在哺乳动物神经元中的表达以及其Gi/o途径激活和光介导突触前释放抑制的能力。经过筛选，发现了脊椎动物脑视蛋白（OPN3）的蚊源同源物，这是一种双稳态Ⅱ型视紫红质，可以有效且特异性地募集Gi/o级联信号。

光遗传学作为神经科学研究的一个重要手段，能够在时间和空间上精确调控神经活动，从而了解神经投射环路的重要功能。

目前已有的光遗传学工具应用于突触前末端时存在低效率（eNpHR3.0）以及脱靶效应（eArch3.0），而化学遗传手段虽然能够通过结合GPCR来调控突触前末端神经递质的释放，但时空精确性不足。

那么是否能够有一种不易受光漂白的Gi/o偶联视紫红质，能够实现高效且靶向光调控突触前神经递质的释放呢？

近日，来自于以色列魏兹曼科学研究所神经生物学系的Ofer Yizhar研究员及其博士后学生Mathias Mahn基于上述思考，筛选开发了新的光遗传学工具，即是脊椎动物脑视蛋白的靶向增强型蚊源同源蛋白（eOPN3），这一蛋白能够通过Gi/o信号通路来减少突触前末端神经递质的释放进而有效抑制突触传递。

1.eOPN3的筛选与构建

在脊椎动物和无脊椎动物中，双稳态II型视紫红质含量很高，且其光漂白作用很低。许多已知的脊椎动物视紫红质都能够通过Gi/o途径偶联，然而它们在G蛋白解离后作为其自然光转导周期的一部分经历了光漂白。

通过对数种双稳态视紫红质变体进行测试，特别针对它们在哺乳动物神经元中的表达以及其Gi/o途径激活和光介导突触前释放抑制的能力。

经过筛选，发现了脊椎动物脑视蛋白（OPN3）的蚊源同源物，这是一种双稳态Ⅱ型视紫红质，可以有效且特异性地募集Gi/o级联信号。

进一步地对OPN3进行改造，将ER转运信号（ER）与高尔基体运输信号（ts）一起添加到OPN3，产生增强的OPN3-ts-mScarlet-ER（eOPN3），可在培养的海马神经元中提高总体表达并增强膜靶向性。

经过验证，eOPN3蛋白的吸收光为512nm，且在哺乳动物神经元中有良好的耐受性，也不会导致神经元兴奋性的显着光依赖性生理变化（图1）。

图1 eOPN3的构建

2.eOPN3的功能验证

在器官型海马切片培养物的锥体神经元胞体-树突区域中能观察到eOPN3-mScarlet的表达，给光后也能触发内源性G蛋白偶联的钾离子内流通道（GIRK），表明eOPN3能够在海马CA3的椎体神经元中表达并向远端的CA1轴突末端转移，并激活Gi/o信号通路（图2）。

图2 eOPN3激活Gi/通路的GIRK通道

进一步地，对表达eOPN3的海马神经元给光调控，能够导致兴奋性长时程突触后电流（EPSCs）的减小，成对脉冲比率（PPR）的增加；而海马中间神经元地抑制性突触后电流（IPSCs）的PPR也同样增加，表明eOPN3能够有效抑制突触前神经递质的释放（图3）。

同样地，在海马切片中对CA1轴突末端进行局部给光激活，也能够抑制EPSCs，但不影响CA3的神经元胞体动作电位，证明了eOPN3在轴突中的激活是有效且不影响胞体的兴奋性。

图3 eOPN3抑制海马神经元神经递质释放

最后，为了验证eOPN3在体内调控神经环路的有效性，在小鼠的黑质致密部（SNc）进行了单侧eOPN3表达。

结果表明，给光激活SNc的eOPN3能够有效抑制SNc到对侧背侧纹状体（DMS）的多巴胺能神经元投射环路，导致小鼠在自由运动过程中出现了明显的偏向性（图3），这与以往文献中报道的单侧抑制SNc可能会引起动物的运动偏好性现象一致。

图4 光激活eOPN3能够抑制单侧SNc

总 结

这项研究与Bruchas 和Gereau实验室使用七鳃鳗parapinopsin（PPO）[1]是首次描述了双稳态非视觉性视紫红质的光遗传学应用，可有效经光控门控沉默突触传递。

eOPN3和PPO的独特光谱特征，特别是在它们的两个光子截面中，将有可能使它们共同用于细胞内信号转导的双通道光遗传学控制。这两种视紫红质是广泛的非视觉视紫红质家族的一员，该家族的其他成员在异源表达时表现出结合Gi/o信号通路的性质。

这两种非视觉视紫红质蛋白的应用提示着该家族的其他成员可能具有相同的开发潜力，希望未来能够被进一步工程化以达成光谱调谐或特异偶联G蛋白通路。

参考文献

[1] Copits BA Gowrishankar R O'Neill PR Li JN Girven KS Yoo JJ Meshik X Parker KE Spangler SM Elerding AJ Brown BJ Shirley SE Ma KKL Vasquez AM Stander MC Kalyanaraman V Vogt SK Samineni VK Patriarchi T Tian L Gautam N Sunahara RK Gereau RW 4th Bruchas MR. A photoswitchable GPCR-based opsin for presynaptic inhibition. Neuron. 2021 May 10:S0896-6273(21)00307-X.

编译作者：Sybil（brainnews创作团队）

校审：Simon（brainnews编辑部）