elisa试剂盒使用教程：ELISA实验常见问题三

elisa试剂盒使用教程：ELISA实验常见问题三Q3：试剂盒能否分次使用？没有用完的试剂组分如何存放？A2：我司提供的ELISA试剂盒，除添加BSA作为保护蛋白外，无任何其他动物来源成分，符合卡塔赫纳生物安全协议要求。此外，试剂盒防腐剂采用毒性较低的proclin 300，安全环保。经营临床诊断类产品的机构需要取得《医疗器械经营企业许可证》；经营科研试剂的机构不需要此证件。临床试剂盒一般仅用于检测人血清/血浆等较为单一的分泌性样本类型；科研试剂盒的样本检测种类、检测范围则比临床试剂盒宽广得多。但一般来说，临床试剂盒的质量、稳定性等性能会优于科研试剂盒。Q2：ELISA试剂盒是否含有有毒有害成分？试剂盒安全性如何？

本期推文，咱们接着往期内容《ELISA实验常见问题（一）》（点击查看） ，继续分享大家关心的ELISA试剂盒、实验样本、ELISA数据处理相关问题，帮助大家更好地开展实验。快来一起围观学习吧！

试剂盒

Q1：科研试剂盒与临床试剂盒的区别 ？

A1：临床试剂是经过权威机构认可的，如FDA、CFDA等；而科研试剂一般是厂家自主研制，不需要通过权威机构验证。

经营临床诊断类产品的机构需要取得《医疗器械经营企业许可证》；经营科研试剂的机构不需要此证件。

临床试剂盒一般仅用于检测人血清/血浆等较为单一的分泌性样本类型；科研试剂盒的样本检测种类、检测范围则比临床试剂盒宽广得多。但一般来说，临床试剂盒的质量、稳定性等性能会优于科研试剂盒。

Q2：ELISA试剂盒是否含有有毒有害成分？试剂盒安全性如何？

A2：我司提供的ELISA试剂盒，除添加BSA作为保护蛋白外，无任何其他动物来源成分，符合卡塔赫纳生物安全协议要求。此外，试剂盒防腐剂采用毒性较低的proclin 300，安全环保。

Q3：试剂盒能否分次使用？没有用完的试剂组分如何存放？

A3：试剂盒可以分次使用。我们的酶标板条是可拆卸的，您可以根据实验需求，确定每次实验所需的酶标板条数量及各试剂组分含量。

溶解后的标准品，建议以最高浓度/母液，分装保存于-20℃条件下，避免反复冻融，半个月内使用有效。

生物素化抗体工作液及HRP酶结合物工作液需现配现用。未用完的浓缩液及其他组分，需要按照说明书要求，分别及时地保存于2~8℃/-20℃条件下，一般可存放6个月。

样本

Q1：高脂样本该如何处理？

A1：高脂样本含有脂肪，不是均质溶液，若直接上样，会影响抗原抗体的结合，导致测值不准确。建议先大转速（5000×g）离心，静置10min后，取中层较澄清液体，再用大转速（≥5000×g）离心一次，取中下层清液，用于检测。

Q2：样本稀释方案是怎样的？

A2：试剂盒检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围。实验前，建议通过相关文献预估样本中待测物的浓度，并通过预实验确定样本的实际浓度情况。

如果您的检测样本需要稀释，参考稀释方案如下：

稀释100倍：一步稀释。取5μL样本到495μL标准品&样本稀释液内，做100倍稀释；

稀释1000倍：两步稀释。取5μL样本到95μL标准品&样本稀释液内，做20倍稀释，再取5μL 20倍稀释样本到245μL标准品&样本稀释液内，做50倍稀释，总共稀释1000倍；

稀释100000倍：三步稀释。取5μL样本到195μL标准品&样本稀释液内，做40倍稀释，再取5μL 40倍稀释样本到245μL标准品&样本稀释液内，做50倍稀释，最后取5μL 2000倍稀释样本到245μL标准品&样本稀释液内，做50倍稀释，总共稀释100000倍；

每步稀释时，取液量不少于3μL，稀释倍数不超过100倍。每步稀释都需混合均匀。

Q3：大小鼠采血容量？

A3：根据实验方案所需采血量的要求，我们可以选择不同的采血方式。

鼠尾采血法：

取血量较少时，采用此方法。通常选择剪断尾巴进行采血。亦可不剪尾，用7-8号注射针头刺入尾静脉采血。

小鼠每次可取血0.1mL，大鼠每次可取血0.2~0.4mL，可多次反复采血。

眼眶静脉丛采血法：

取血量中等时，采用此方法。持玻璃毛细管，从眼内眦部以45°刺入眼眶静脉丛，进行采血。

小鼠每次可取血0.2~0.3mL，大鼠每次可取血0.4~0.6mL，可多次反复采血。

断头采血法：

取血量较多时，采用此方法。无需麻醉动物，快速剪掉头颈部，倒立动物，让血液自由滴入容器。

小鼠可取血0.8~1.2mL，大鼠可取血3.0~8.0mL，此方法为致死性采血。

数据处理

Q1：标准曲线使用的是什么拟合函数？可以用Excel来制作标曲吗？为什么我做出的标准曲线不是一条直线？

A1：推荐使用Origin软件，或者其他含有4-PL（四参数logistic）函数模型的软件去拟合得到标准曲线。4-PL拟合方式能够更精确地反映浓度和吸光度的线性关系，从而更准确地获得样品中待测物质的浓度值。Excel拟合方式一般为直线和多项式，这两种拟合方程均不推荐作为ELISA标曲的拟合方式。

Origin软件可点击此链接下载安装包：

https://special-a.oss-cn-qingdao.aliyuncs.com/Origin_9.1.zip

Q2：如何使用Origin绘制标准曲线＆计算ELISA实验结果？

A2：ELISA实验的结果计算包括标准曲线拟合和样本浓度计算。计算标准品和样品复孔的平均OD值，并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在双对数坐标上拟合四参数的逻辑函数标准曲线，再将样本OD值代入标曲，即可得到样本浓度值。若样本测定前被稀释，则样本实际浓度需乘以稀释倍数。

关于Origin的详细操作步骤，可参考往期推文《ELISA实验指南！！新手必读》（点击查看）。

Q3：说明书中的标曲可以直接用来计算吗？若实际标曲的OD值及图像与说明书上有差异，是什么原因导致的？

A3：说明书上的标曲是指示标曲，主要用于呈现拟合后标曲的形态，及最高/最低OD值的质控范围。由于受实验操作、实验环境及仪器参数设定等因素的影响，客户实际做出的标曲OD值可能会与说明书不一致（整体偏高或偏低）。这种情况下，建议在显色阶段控制前4个蓝色孔，使之呈现明显的颜色梯度。标曲的最大OD值在1.2以上，相关系数在0.99以上，即可作为有效标曲。

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