结核杆菌和肺组织细胞基因表达：肺结核患者外周血单个核细胞中miRNA-150的表达及意义

研

究

内

容

和

预

期

成

果

摘

要

选择41例肺结核患者（TB）为实验组(其中19例为涂阳患者，22例为凃阴患者)，同时选择35例健康人群（HD）为对照组。采集外周抗凝血利用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，提取总RNA，利用TaqMan探针qPCR技术检测miRNA-150在各组人群中的相对表达量，以RNU6B作为内参基因。实验方法：(1)样本采集，采集两组研究对象的外周血5ml，肝素锂抗凝，标本采集后12h内，采用密度离心法，离心参数为930xg，15min进行PBMC的分离，分离出PBMC后计数。(2)miRNA提取，采用OMEGA公司E.Z.N.AmiRNA Kit试剂盒从PBMC中提取总的RNA(严格按照试剂盒说明书进行)，用超微量分光光度计(美国安捷伦科技有限公司)测定RNA的质量及浓度，并于-80℃保存。(3)TaqMan qPCR技术测定miRNA-150的表达，使用美国ABI公司的TaqMan MicroRNA Assays探针进行qPCR测定miRNA的相对表达量。首先利用TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit将RNA反转录成cDNA，然后进行qPCR扩增，反应体系如下:TaqMan Universal PCR Master MixⅡ7.5μL，TaqMan Small RNA Assay 0.75μL，cDNA2.0μL，ddH2O 4.75μL。反应条件为:95℃，15s，60℃，60s，40个循环。采用荧光定量PCR中的相对定量法，以RUN6B作为内参，以2-△△Ct计算miRNA-150相对表达量。

主题词

1、主题词限填二个；2、主题词之间各空一格；3、按《医学主题词表MESH》填写

肺结核;外周血单个核细胞;微笑 RNA-150

（包括国内外研究现状分析、当前需要解决的主要问题等）

肺结核病被列为我国重大传染病之一，是严重危害人民群众健康的呼吸道传染病[1]。同时，我国肺结核发病和死亡人数历年来一直居于甲乙类法定报告传染病发病和死亡人数前3位。因此及早发现活动性肺结核患者是切断传播源，控制肺结核病的关键[2]。然而对结核的诊断目前仍然缺乏快速有效的方法[3]。现应用于临床的有痰涂片、痰培养，分枝杆菌聚合酶链反应(PCR)、固相酶联免疫斑点技术(ELISPOT)等[4 5]。传统的结核分枝杆菌培养法需时太长，涂片法阳性率又低；PCR检测到的是细菌DNA，不能区别结核分枝杆菌的“死”与“活”，还需深入研究；ELISPOT实验敏感性虽高，但是不能有效区分结核分枝杆菌潜伏感染及活动性肺结核[6 7]。近年来越来越多的学者寻找诊断结核新的标识，其中热点之一是微RNA(miRNA)，miRNA是一类广泛存在于真核细胞，长度约20bp的高度保守的微小RNA分子，能与对应的靶mRNA的3’非翻译区的非完全或完全配对结合，阻止其翻译或破坏其稳定性，实现对基因表达的调控[8 9]。有的研究发现有17种miRNA在结核患者、结核潜伏感染人群及健康人群全血PBMC之间是存在差异性表达[10]。也有研究显示miRNA可能成为早期诊断结核新的标识[11]。

miRNA做为新的标识物，其性质稳定，可以抵，抗热、酸碱等物理及化学变化，而且直接抽取外周血，获得标本，方法简便、快速无侵入性[12]。近年来研究发现miRNA参与细胞的生长、分化、凋亡等各个环节，并参与了多种疾病的发病机制[13]。特别是在肿瘤方面众多研究表明miRNA有望成为早期，诊断肿瘤的分子标识。未来是否也会成为诊所，断结核的分子标识呢?所以在结核诊断领域也做了大量的研究[14-17]。有的学者用miRNA芯片技术检测了活动性TB患者外周血1223个miRNA，有92个在血清中差异表达，其中59个为高表达、3个为低表达[18]。其中miRNA-29a不管是在TB外周血还是在痰液中表达明显上调，ROC曲线显示其诊断结核的敏感，性及特异性性分别达到83%、80%[19]。有学者发现miRNA在特定的种族当中，诊断结核的敏感性可达到95%，特异性甚至达到100%[20]。有学者研究发现miR-155能通过结合到Ras蛋白脑组织同源类似物(RHEB)的mRNA非翻译区，通过抑制RHEB表达加快了巨噬细胞自噬反应从而杀死细胞内分枝杆菌[21]。这些表明了miRNA在活动性TB感染中扮演重要角色[22]。提示miRNA可能成为诊断活动性TB的新的标识[23]。

miRNA-150作为miRNA的成员，有研究表明它在各类疾病当中也是存在差异性表达的，可能是miRNA分子中诊断各类疾病的新的标识物之一[24]，比如有的学者利用qPCR技术验证了miRNA-150在心房颤动患者体内的表达低于健康人[25]。Rossetti MLR等用基因芯片技术发现miRNA-150在胃癌患者当中具有差异性表达，受试者工作曲线(ROC曲线)下面积为0.73，可能是诊断胃癌的一个良好指标[26]。Balganesh TS等的研究也发现miRNA-150在结肠癌患者中表达是上调的，他认为其可以做为诊断肿瘤的一个新的标识[27]。但在结核的领域内仍然缺乏对miRNA-150的研究。

参考文献：

[1]张娟 孙炳奇 王悦等.RNA恒温扩增实时检测技术在肺结核诊断中的价值[J].实用医学杂志 2013 29(17):2893-2895.

[2]付玉荣 伊正君 李建花等.微小RNA-29a在肺结核患者血清中的表达及其生物学功能预测分析[J].中华结核和呼吸杂志 2013 36(3):186-190.

[3]侯杏芳 孟娟 张国良等.肺结核患者外周血单个核细胞中miRNA-150的表达及意义[J].临床肺科杂志 2016 (3):501-504.

[4]刘光艳 郑虹.检测肺结核早期患者血清miRNAs的临床意义[J].实用医院临床杂志 2013 10(5):193-194.

[5]林巧 钟红剑 邹容容等.外周血CD14 单核细胞微RNA在结核分枝杆菌潜伏感染和肺结核中的差异表达[J].中华临床感染病杂志 2015 8(1):20-25.

[6]姚思敏 邹容容 张国良等.miRNA分子在肺结核患者单核细胞中的表达及意义[J].中国热带医学 2015 15(1):1-3.

[7]范琳 王鹏 杨妍等.RNA恒温扩增实时荧光检测技术检测支气管肺泡灌洗液对涂阴肺结核的快速诊断价值[J].中国防痨杂志 2015 37(2):140-144.

[8]刘守江 张帆 魏巍等.外周血miR-29a-3p、miR-365a-3p在活动性肺结核和结核潜伏感染者中的表达[J].中国医药导报 2013 10(22):36-38.

[9]任斐 周永 严文等.支气管肺泡灌洗液RNA恒温扩增检测涂阴肺结核的诊断价值[J].临床肺科杂志 2015 (11):1968-1971 1972.

[10]刘守江 张帆 魏巍等.结核潜伏感染者全血miR-144-3p、miR-146a-5p的表达[J].临床肺科杂志 2013 18(7):1270-1271.

[11]张国良 邹容容 钟红剑等.外周血单核细胞miRNA表达谱在肺结核中的诊断价值[J].中国热带医学 2014 14(12):1419-1422.

[12]杨丹 陈耀凯 吕圣秀等.HIV合并肺结核患者中CD4、HIV-RNA与肺门及纵膈淋巴结肿大的关系[J].医药前沿 2014 (22):101-102 103.

[13]朱世长 张敬 张军等.微小核糖核酸在肺结核中的研究进展[J].中华传染病杂志 2015 33(2):122-124.

[14]央拉 李长山.肺结核相关microRNA研究进展[J].中国防痨杂志 2015 37(2):194-198.

[15]杨先涛 张祯祯 詹学等.肺结核患儿外周血单个核细胞中microRNA表达的初步研究[J].第三军医大学学报 2013 35(19):2051-2055.

[16]伊正君 付玉荣 李瑞芳等.活动性肺结核患者痰液中miR-29a的表达[J].中华微生物学和免疫学杂志 2012 32(4):333-334.

[17]张立群 孙照刚 高孟秋等.肺结核患者外周血单核细胞中差异表达miRNA的筛选[J].中国防痨杂志 2011 33(11):729-733.

[18]杨丹凤 张林波 张文慧等.微小RNA在传染性疾病诊断中的应用[J].现代预防医学 2015 42(23):4362-4364 4373.

[19]Montenegro R. A. Guarines K. M. Montenegro L. M. L. et al.Assessment of messenger RNA (mRNA) of Mycobacterium tuberculosis as a marker of cure in patients with pulmonary tuberculosis[J].Journal of applied microbiology 2014 117(1):266-272.

[20]Chang JS Huggett JF Dheda K et al.Myobacterium tuberculosis induces selective up-regulation of TLRs in the mononuclear leukocytes of patients with active pulmonary tuberculosis.[J].The Journal of Immunology: Official Journal of the American Association of Immunologists 2006 176(5):3010-3018.

[21]Rosas Taraco AG Higgins DM Sanchez Campillo J et al.Intrapulmonary delivery of XCL1-targeting small interfering RNA in mice chronically infected with Mycobacterium tuberculosis.[J].American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 2009 41(2):136-145.

[22]Taha RA Minshall EM Olivenstein R et al.Increased expression of IL-12 receptor mRNA in active pulmonary tuberculosis and sarcoidosis.[J].American journal of respiratory and critical care medicine 1999 160(4):1119-1123. [23]Walter Nicholas D. Dolganov Gregory M. Garcia Benjamin J. et al.Transcriptional Adaptation of Drug-tolerant Mycobacterium tuberculosis During Treatment of Human Tuberculosis[J].The Journal of Infectious Diseases 2015 212(6):990-998.

[24]Mdivani N Li H Akhalaia M et al.Monitoring therapeutic efficacy by real-time detection of Mycobacterium tuberculosis mRNA in sputum.[J].Clinical Chemistry 2009 55(9):1694-1700.

[25]Pai SR. Actor JK. Sepulveda E. et al.Identification of viable and non-viable Mycobacterium tuberculosis inmouse organs by directed RT-PCR for antigen 85B mRNA[J].Microbial Pathogenesis 2000 28(6):335-342.

[26]Rossetti MLR. Rodrigues VDS Moura AR. et al.IMPROVEMENT OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS DETECTION IN CLINICAL SAMPLES USING DNA PURIFIED BY GLASS MATRIX[J].Journal of Microbiological Methods 1997 28(2):139-146.

[27]Balganesh TS Balasubramanian V Kumar SA et al.Drug discovery for tuberculosis: Bottlenecks and path forward[J].Current Science: A Fortnightly Journal of Research 2004 86(1):167-176.

（研究目标、研究内容和拟解决的问题）

研究目标：

分析外周血单个核细胞(PBMC)中 miRNA-150 在肺结核患者(TB)及健康人群(HD)中

的表达差异，探讨 miRNA-150 诊断活动性肺结核的应用价值。

研究内容：

1.样本采集：采集两组研究对象的外周血5ml，肝素锂抗凝，标本采集后12h内，采用密度离心法，离心参数为930xg，15min进行PBMC的分离，分离出PBMC后计数。

2.miRNA提取：采用OMEGA公司E.Z.N.AmiRNA Kit试剂盒从PBMC中提取总的RNA(严格按照试剂盒说明书进行)，用超微量分光光度计(美国安捷伦科技有限公司)测定RNA的质量及浓度，并于-80℃保存。

3.TaqMan qPCR技术测定miRNA-150的表达：使用美国ABI公司的TaqMan MicroRNA Assays探针进行qPCR测定miRNA的相对表达量。首先利用TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit将RNA反转录成cDNA，然后进行qPCR扩增，反应体系如下:TaqMan Universal PCR Master MixⅡ7.5μL，TaqMan Small RNA Assay 0.75μL，cDNA2.0μL，ddH2O 4.75μL。反应条件为:95℃，15s，60℃，60s，40个循环。采用荧光定量PCR中的相对定量法，以RUN6B作为内参，以 2-△△Ct

计算miRNA-150相对表达量。

拟解决关键问题：

一是患者病例选择问题：为获得符合统计学要求的患者病例数目，应选择符合研究对象质量控制标准的长期积累病例。

二是治疗过程中的随访调研问题：患者治疗过程中随访比较困难，可以联系家属进行随访调研工作。

三是用药依从性问题：嘱咐患者及其家属严格按照既定治疗方案进行药物服用。在治疗过程中如果有退出病例应及时剔除，避免影响结果判定，另外，在治疗过程中因其他原因不能按时进行血液样本采集的患者应明确说明。

四是统计学问题：统计学处理所有临床资料采用SPSSl9．0统计分析软件包。计量资料属正态分布的采用x±s表示，采用独立样本t检验，计数资料采取率的比较x2检验，P<0．05为有统计学意义。

（采用的研究方法和技术路线及可行性分析）

研究方法：

选择41例肺结核患者（TB）为实验组(其中19例为涂阳患者，22例为凃阴患者)，同时选择35例健康人群（HD）为对照组。采集外周抗凝血利用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，提取总RNA，利用TaqMan探针qPCR技术检测miRNA-150在各组人群中的相对表达量，以RNU6B作为内参基因。

临床症状疗效方面：

1. 肺结核患者与健康人外周血 PBMC中miRNA-150 的表达水平：选择41例活动性TB患者及35例健康人(HD)，分离出PBMC，提取总RNA，最后利用 TaqMan qPCR 技术测定 miRNA-150的表达，采用统计软件分析，差异性表达比较采用 t 检验，两组组间比较 差异是否有统计学意义(P>0.05无统计学意义，P<0．05有统计学意义)。。

2.外周血单个核细胞中 miR-150 诊断 TB 的效果评价：为了进一步评价 miR-150 诊断 TB 的价值，以miRNA 表达水平为测试变量，TB 诊断作为状态变量绘制 ROC 曲线，并分别计算 AUC、敏感性、特异性。采用统计软件分析，差异性表达比较采用 t 检验，两组组间比较 差异是否有统计学意义(P>0.05无统计学意义，P<0．05有统计学意义)。

3. 痰涂片阳性与阴性TB患者PBMC中miRNA-150表达水平：我们根据痰涂片检验结果，进一步将41例TB患者人群分为痰涂片(AFB)阳性( )组及痰涂片(AFB)阴性( - )组，比较两组人群 miRNA-150 表达差异，看差异有无统计学意义(P>0.05无统计学意义，P<0．05有统计学意义)。

技术路线：

根据诊断标准选入肺结核患者，同时选择健康人群

根据纳入标准、排除标准剔除部分患者，余下数例

TB为实验组，HD为对照组，两组一般资料无明显差异后开始研究

对照组：采集外周血、提取miRNA并测定表达

实验组：采集外周血、提取miRNA并测定表达

对比miRNA表达差异及应用价值

讨论

（科学价值、社会效益、经济效益分析）

miRAN-150 在诊断TB中具有较大的潜力 具有较高的敏感性和特异性。由于我们筛选的 miRNA 均来自外周血PBMC，而 PBMC 中细胞成分复杂 不同细胞群之间的比例对 miRNA 表达水平具有较大影响。 如果能用 PBMC 中单一的免疫细胞做为研究对象可能结果会更理想。另外我们样本数量有限 还需要进一步扩大临床样本数量验证我们的结果。对痰涂片阳性与痰涂片阴性结核患者之间miRNA-150表达谱进行比较，发现其在痰涂片阳性TB患者中的表达是上调的，涂阳和涂阴只之间的差别，提示miR的表达与结核菌载量密切相关，即结核菌越多表达水平越高。由此可以显示miRNA-150在TB患者PBMC中表达水平升高，尤其是涂阳患者，可以作为诊断 TB 的分子标识，具有积极的临床意义，获得认可后值得推广。

。