重症肺部感染早期如何精准诊断病因，重症肺部感染早期如何精准诊断
重症肺部感染早期如何精准诊断病因，重症肺部感染早期如何精准诊断这是我们现在的想法：呼吸道标本合格标准：这是我们做的床旁ROSE，是我们科室护士长的一个课题。使用生理盐水常规进行口腔护理，口护前，口腔内存有大量定植菌；口护2h后，定植菌有所减少；但是到了4h、6h、8h后，定植菌又增多。所以，在ICU中定植菌无处不在，如何鉴别病人到底是感染还是非感染？培养出来的就是感染的菌群吗？ 所以，现在的临床医生是非常无奈的，临床需求是希望快速、精准、个体化（主要是单个样本进行检测）。无奈现实是检测全部依赖于检验科实施，临床一线医务人员非常被动；下呼吸道标本标本合格率20%，无法鉴别污染、定植、感染；而且ICU患者下呼吸道标本留取没有规范；虽然感染学组制定了专家共识，但这版共识不适用在ICU中推广，感染结果方法传统，效率低下，时间滞后（48-72h），常常是仅供临床参考；院内感染似乎误解；经验性应用广覆盖、超广谱抗菌素陷入恶性循环，重症感染患者同时应用5-7种抗菌
呼吸与危重症医学科的很多病人都是感染性疾病，感染在ICU中是永恒的话题。但是，实际上我们每天诊治的很多病人到底是感染还是非感染，并不是很清楚，包括我自己有时也云里雾里。下面先给大家举个例子。
临床的无奈
一位从胸外科转入我们科室的病人，胸外科术后继发ARDS，没有任何感染的因素存在，到我们科室主要做ECMO。这个病人6月17日转入我科，我们用科研经费给他做了mNGS，如上图所示，他的口咽部、气囊上方、气道远端均未发现ICU常见的定植菌。6月19日，他的口咽部和下呼吸道都出现鲍曼不动杆菌。直到6月24日，ICU的常见定植菌拷贝数越来越多。这个病人很幸运，虽然有很多定植菌，但是在一周内拔管，不到两周又转回胸外科。这个病人根本没有发烧，做mNGS有什么意义呢？
这是我们做的床旁ROSE，是我们科室护士长的一个课题。使用生理盐水常规进行口腔护理，口护前，口腔内存有大量定植菌；口护2h后，定植菌有所减少；但是到了4h、6h、8h后，定植菌又增多。所以，在ICU中定植菌无处不在，如何鉴别病人到底是感染还是非感染？培养出来的就是感染的菌群吗？
所以，现在的临床医生是非常无奈的，临床需求是希望快速、精准、个体化（主要是单个样本进行检测）。无奈现实是检测全部依赖于检验科实施，临床一线医务人员非常被动；下呼吸道标本标本合格率20%，无法鉴别污染、定植、感染；而且ICU患者下呼吸道标本留取没有规范；虽然感染学组制定了专家共识，但这版共识不适用在ICU中推广，感染结果方法传统，效率低下，时间滞后（48-72h），常常是仅供临床参考；院内感染似乎误解；经验性应用广覆盖、超广谱抗菌素陷入恶性循环，重症感染患者同时应用5-7种抗菌药物屡见不鲜，超级细菌大行其道，无药可治成为现实。
因此，我们能否实现重症感染患者床旁病原学快速精准检测？
呼吸道标本合格标准：
这是我们现在的想法：
> 病原学快速诊断技术能否前移到床旁，在第一时间能够快速诊断；
> 能否判断是上呼吸道、下呼吸道、肺泡灌洗液来源标本；
> 能否鉴定污染、定植、感染；
> 能否鉴别感染与非感染；
> 能否初步判定细菌、真菌感染。
ICU床旁快速评价-MROSE
我们现在考虑能否在床旁由临床医生进行气管镜取材、标本印片、快速染色、显微镜下阅读，如果能够在床旁完成，就能在第一时间去鉴别标本来源部位、是否合格、是否感染、初步判定细菌、真菌属一级。在这种情况下，1-2个小时完成，是最简单的方式。我现在要求我们科室的ICU医生，不仅是呼吸与危重症科医生，还要是病理科医生和微生物科医生，要会看细胞组织，还要会看微生物组织。
不合格的BALF标本
1）不合格的BALF-鳞状上皮超标
这是完全不合格的标本，鳞状上皮超标。此BALF标本为口咽部，虽然做了肺泡灌洗液，但是把口咽部的这些分泌物全部加到下呼吸道，如果使用这种标本去判断，对病人无益。
2）不合格的BALF-柱状上皮超标
这是柱状上皮细胞，已经进入大气道了，在一级、二级支气管。实际上这种情况非常好判断这个标本合格与否。
3）不合格的BALF-红细胞超标
这是完全把标本弄混了。这个病人的气道本身没有出血，但因为是重症感染的病人，气道很脆弱，容易出血，出现大量的红细胞。这样的话，导致很多中性粒细胞进入，所以到底是感染还是非感染不好判断。
合格的标本
标本有很多细节，大家有时候没有注意到这是不是合格的标本。上图为合格的标本。实际上有很多标准、指南，大家需要把合格的标本记下来，比如红细胞＜10%（除外创伤/出血因素），上皮细胞＜3%~5%；（低倍镜下鳞状上皮＜1%，柱状上皮＜5%）涂片细胞形态完整，无变形，分布均匀。如果知道什么是合格的标本，自己就可以去判读。所以，床旁MROSE技术在床旁是完全可以实现的，在我的ICU已经成为常规。
微生物形态学判断
细菌形态学包括革兰染色为阳性或阴性，菌体如何判断，荚膜如何判断，做抗酸染色、六胺银；真菌形态学包括菌丝、孢子。临床医生都要去学习，学到以后对临床工作非常有用。这个月我们把荧光染色法也作为常规开展起来，解决了很多以前忽视的问题。
常见细菌：
上图均为我们所做的真实的标本。我们最近又诊断了两例金黄色葡萄球菌的病人，以前在社区获得性肺炎中的金葡菌比较少见，现在来看并不少见。其实这些细菌都有各自的特点，多看一些标本就能了解很多，有经验的医生对临床第一时间的诊断非常重要。
常见真菌：
这是一些常见的真菌，也是我们所做的标本。基本上不管病人来的多晚，我们都要在第一时间做。
验证结果
这分别是床旁ROSE和培养 药敏的结果。4月9日，我们通过ROSE在2小时内诊断为曲霉属，过了4天培养出来是曲霉菌和鲍曼不动杆菌；4月13日，还是曲霉菌，但是很不幸这个病人发生了院内感染，病情严重，进行了气管插管；4月20日ROSE结果为假单胞菌属，过了5天，培养出来是铜绿假单胞菌；4月30日出现不动杆菌。我们做的ROSE诊断基本上和培养结果匹配，而且都是在2小时内得出ROSE结果，这对于病人的诊断而已，有极大的帮助，大家可想而知。
ICU快速诊断区域
我们现在不断尝试自动化操作机器，因为现在看染色、涂片、扫描、识别，400张高倍视野的标本花费的时间很久。现在我们全部自动化，可以自动染色、自动扫描，而且还能初步自动出结果，大概告诉你是革兰阳性还是革兰阴性，可能是致病菌，然后医生再去判读，以前三四个小时的工作量，现在半个小时就能完成。
人工智能判断标本质量
临床一线使用自动化操作机器，等于是把检验科的涂片技术运用到ICU床旁，能解决很多问题，非常实用。
云端自动鉴定微生物
而且，我们现在已经开始通过云端自动鉴定微生物，这就像二代测序一样，有很多信息需要进行人工识别。我们现在的云端自动鉴定微生物和公司在合作，要提高它识别的准确率，我们还在不断增加样本量。
远程会诊判断病原微生物
目前北京医联体里将近40家医院已经开展云端会诊，他们把标本发给我们，我们的专家去解读，这样能有效解决很多问题。
免疫学微生物检测技术
免疫学技术原理：应用免疫学理论设计的一系列测定抗原，抗体，微生物成分及其分泌的特殊物质的实验方法。其基本原理是抗原抗体反应。最常用的两种免疫检测技术是酶联免疫检测技术和胶体金免疫层析技术。这需要临床医生对致病原已有一个初步倾向。
酶联免疫检测技术
临床开展的酶联免疫检测技术有很多种，但这些免疫学技术只能做一些单一的检测方法，不适合在床旁对多种病原体判读，可能更适合于监护室。
胶体金免疫层析技术
胶体金免疫层析技术在这次新冠疫情中使用较多，它对单一病毒的抗原抗体检测很有价值，但不适用于在监护室对一种标本、可能多种病原体的检测。
微生物质谱检测技术
微生物质谱技术现在发展的非常快，我们医院的检验科现在也有。
质谱检测原理是将完整细菌分解为指带电分子或分子碎片，按质荷比（或质量）的大小顺序排列获得指纹图谱，从而对细菌进行快速鉴定的方法，可以对常见细菌，诺卡菌、分枝杆菌、厌氧菌、酵母菌及丝状真菌进行快速和准确的鉴定。
质谱检测技术分类：
质谱检测技术现在是通过对蛋白质谱和核酸质谱的方法，对已知和未知的病原体的快速检测非常有价值，但不适合在床旁进行，因为机器太大，需要很多相关的硬件设备。但是如果和检验科合作，对于病原学的检测、耐药基因的检测有很多好处。
酶切探针结合LAMP核酸检测技术
我们又研发了基于核酸快速检测的酶切探针等温扩增技术，对ICU重症患者可能致病病原体，包括细菌，真菌，病毒，原虫等做到快速精准检测。
我们使用的酶切探针结合LAMP核酸检测技术由解放军总医院和江苏宏威特斯合作研发，目前可检测临床常见30余种病原（涵盖常见细菌，真菌，病毒）。待这项技术慢慢成熟后，我认为可以弥补MROSE的部分不足。这项技术设备小巧易转运；操作简单，没有专业化操作程序，标本放进去，就可以出结果；检测时间总计不超过2小时，反应时间不超过30分钟；检测灵敏度，特异度均高于传统培养。
我们已经开始研发第二代，我认为对临床非常有帮助。所以，我在考虑，在临床以及在ICU里面，应该形成一个闭环，在床旁2小时内对已知和未知的病原体做到快速检测，这应该也是未来的发展方向。
基于PCR的核酸检测平台
基于PCR核酸检测平台，国外的相关公司有很多设备，但是可能因为设备比较昂贵，开展的不是很多。其实我觉得我们应该基于自己的技术，国内的一些核心技术已经有突破了，完全可以去做咱们自己的事情。
mNGS简介
mNGS不基于培养，直接从环境/临床样品中提取全部微生物的DNA，利用基因组学的研究策略研究环境样品中所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。可广泛分析临床样本微生物组（细菌，真菌，病毒）的高通量测序方法。现在mNGS临床做的很多，大家知道它有很多优势和不足，还是需要扩增。
mNGS重要的参数
现在mNGS最大的问题就是，解读完全依靠公司，到底什么是序列数、基因组的覆盖度、深度、微生物丰度，可能很多临床医生都不清楚。今年在中华结核呼吸杂志第九期，我们就此发布了「宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识」，大家有时间可以查阅，我们是基于临床医生的角度如何去做宏基因组的报告解读，内容写得非常清楚。
序列数（reads）：指匹配到该病原体的序列数目，与标本中病原体本身载量负荷、核酸提取量、人源序列比例有关。Reads 数越高，表示标本中检测到该病原体可信度越高。
基因组的覆盖度：表示检测到的该微生物核酸序列覆盖到该微生物整个基因序列的比值，覆盖度高表示该微生物全基因组测到的比率高。
深度：是指该微生物基因组上某段序列被检测到的次数，深度参数越大表示该微生物被检测到的可靠性越高。
微生物丰度：将病原体按照细菌、真菌、病毒和寄生虫进行分类，相对丰度是该病原体相应分类中基因组相对比例，丰度越高表示其在相同类型微生物中占比例越高。
NGS的临床应用价值
mNGS的动态监测、病原学变化以及耐药基因改变，也是比较好的方法。
mNGS局限性
设备硬件要求高，体积大，无法做到床旁检测；检测时间长，至少24-48h；检测的结果对少见致病菌诊断效率较高，常见条件致病菌无法鉴别定植还是感染；检测技术有待完善，需要扩增，时间增加，测序核苷酸长度是否需要重新界定；耐药基因检测。
这是中华医学会呼吸病学分会呼吸与危重症医学学组和中国医师协会呼吸医师分会危重症医学工作委员会第一次在国内制定的「ICU患者支气管肺泡灌洗液采集、送检、检测及结果解读规范」，全是干货，大家可以参照这个标准。怎么去保存标本，怎么送标本，标本出来后结果怎么判读，规范里面写得非常清楚。另外，临床医生不要完全依靠别人给什么结果，就认定什么结果，大家要客观评价结果。
第三代高通量测序技术
和二代测序比较主要不同点：
设备便携，可实现床旁快速检测
单分子测序（二代测序的荧光技术无法实现单分子测序）
测序过程无需进行PCR扩增，气溶胶污染问题减少
运行时间较短，可于数小时内出结果（目前是6小时）
较高的随机测序错误（可通过重复测序纠正）
直接测RNA的序列
三代测序仪：
Oxford Nanopore（英国牛津纳米孔公司）
PacBio SMRT（美国太平洋生物科学公司）
三代测序可能是未来在床旁能够做已知、未知的高通量测序的非常好的办法。
ONT平台的长读长助力耐药机理探究
ONT平台对于病原体耐药机理的评估也非常好，现在技术逐渐成熟。
鲍曼不动杆菌耐药基因检测：
这是我们和相关公司合作的临床标本的解读结果，我们检测出耐药基因后，给临床进行客观判读，对应抗生素种类，得出建议哪些药物可以使用。这是我们进行的第一步，但是现在对耐药基因检测通过高通量测序也发现了很多问题。我想进一步优化，这样可能在3小时内出现耐药基因的结果，对病人选择合理的抗生素非常有价值。
治疗抗菌药物串联质谱检测
想要精准诊断，还需要个体化治疗。对于个体化治疗，我有一个梦想，就是真正能够检测所有的抗菌药物血药浓度，在这种程度上，能不能动态监测所有药物血药浓度，然后形成一个网，来评价药物之间的相互作用。因为现在做这项技术，发现很多的药物，比如最简单的替加环素，AOC/MRC按照现在的解释可能就是错的，它的血药浓度非常低，我们已经将近验证了20年。所以随着新的技术出现，对于传统概念可能就是颠覆性的。当然，我们首先来说对不对，现在我们进行合作，一次可以检测血清中14种药物的17种成分实时监测，根据临床需要增加抗菌药物品种。
抗菌药物串联质谱检测结果
这是我们对一个病人通过抗菌药物串联质谱检测进行实时监测的结果。
这是一位重症感染的病人，这些药物可以实时检测血药浓度，通过血药浓度就可以判断在不同的治疗干预下是否合适，就能按照这个理论合理化的个体化用药，才能奠定基础。因此，我认为随着新技术的突破，我非常看好未来的前景，治疗每个病人真正做到可视化，明明白白、清清楚楚地治疗每个病人，不然咱们现在全都是蒙着干。
梦想与现实
ICU床旁致病原精准检测（2小时内）：MROSE-酶切探针等温扩增核酸检测-三代 快速测序，二代测序现在还有很多不足，三代测序要不断优化升级。
我们最近做了一项很有意思的研究，让一位支气管扩张的病人进入完全消杀的环境中，他待了2小时后环境中的细菌的微生态明显改变，铜绿假单胞菌明显上升，而且最大的问题是，比如这个环境微生态的总体细菌数是1万个，本来有几十种细菌，这个病人进去以后铜绿假单胞菌就是8000个，阻碍了其他细菌的生长，导致微生态紊乱。所以在这种情况下，我们要进行探索，明确环境微生态与患者宿主微生态相互影响动态变化规律，就像开篇提到的第一个病人，下呼吸道肺泡灌洗液有很多鲍曼不动杆菌，为什么这个病人不发烧，不得肺炎？
明确致病原耐药信息、动态监测所有药物血药浓度和相互之间的影响，如果这是一片网络环的话，这样的精准治疗会带给我们什么？希望能够实现。还要指导个体化精准抗感染治疗。
参考文献
[1]SEMINARS IN RESPIRATORY AND CRITICAL CARE MEDICINE/VOLUME 28 NUMBER 5 2007
[2]宋振举，童朝阳，等 宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识.中华急诊医学杂志 2019 28(2):149-153.
专家介绍
解立新
解放军总医院第一医学中心呼吸与危重症医学科科主任，主任医师、教授，博士研究生导师，医学博士，中华医学会呼吸病分会全国委员、危重症学组组长，中国呼吸医师协会危重症工作委员会副主任委员；中国抗感染协会（IDSC）常务理事兼秘书长。
本文由《呼吸界》编辑 大奔 整理，感谢解立新教授的审阅修改！
本文完
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