mirna生物学特性（植物miRNA文章7材料方法）
mirna生物学特性（植物miRNA文章7材料方法）为了分析 miRNA 测序数据，首先过滤原始数据以修剪测序接头并去除低质量读数。然后，对长度在 18 nt 和 36 nt 之间的读数进行计数，并去除相同的读数以获得独特的读数。Rfam 11 数据库用于通过对数据库进行独特的读取来识别核糖体 RNA (rRNA)、转移 RNA (tRNA)、小核 RNA (snRNA) 和小核仁 RNA (snoRNA) 44。与四种 RNA 不匹配的读数用于下一步分析。这些读数针对成熟的甜瓜 miRNA 序列（miRBase 21，http://www.mirbase.org/）进行爆炸，以鉴定已知的保守 miRNA 45. miRNA 的表达通过每百万读数 (CPM) 进行标准化。DESeq（版本1.18.0）软件用于计算miRNA差异表达46。miRNA 的临界值是 log2|fold change|> 1 和p值 < 0.05。分层聚
note: 翻译使用google，并不严谨
Genome-wide identification of microRNAs involved in the regulation of fruit ripening and climacteric stages in melon (Cucumis melo)参与调控甜瓜（Cucumis melo）果实成熟和跃变期的microRNA的全基因组鉴定
甜瓜（Cucumis melo cv. Hetao melon）植株于2016年在中国内蒙古自治区灯口县（N40°19′46.07″，E107°0′11.46″）的温室中种植。花朵为自花授粉，记录授粉时间，授粉日期记为授粉后0天（DAP）。每株甜瓜只保留一个果实。然后，收获 G 期（18 DAP）和 R 期（36 DAP）的果实，将 5 g 中果皮立即在液氮中冷冻，并保存在 -80 °C 的冰箱中以备后续分析。对于每个样品，从不同植物获得 3 个重复。
为了获得更年期的瓜果，我们选择了颜色刚刚变成全黄色（约40 DAP）的瓜果。然后采收果实，立即用红外CO 2分析仪（中国浙江拓普仪器有限公司）测量果实的呼吸速率，每2 h测量一次呼吸速率，直至CO 2浓度迅速升高43 . 然后，立即将甜瓜果实的中果皮在液氮中冷冻。为了获得更年期后的果实，当 CO 2浓度达到峰值时，测量果实的呼吸速率直到大约 48 h，CO 2浓度回到起始水平；因此，获得了更年期后的水果样品（约 42 DAP）。使用水果针入度计（EFFEGIDI，FT 011，意大利）测试水果硬度。在中果皮的垂直截面上测量了四个对称点。按照说明（袖珍折光仪：ATAGO，Cat. No. 3830，日本）测试可溶性固形物含量。
栽培瓜子，选用丰满的种子，用75%酒精浸泡2 min，0.1% HgCl 2消毒8 min。种子在人工气候培养箱中的 1/2 MS 培养基中培养：16 小时光照/8 小时黑暗培养，24-26 °C，60% 相对湿度。长出5片叶子后，取1 g根、茎、叶和子叶组织，立即液氮冷冻，-80℃冰箱保存，不同植株各取3个重复。
2015年，我们还在灯口县的大棚里种了瓜。作为预实验，我们在 18 DAP 和 36 DAP 收获果实。保留果实的中果皮，每个样品从不同植物中获得 3 个重复。样品处理和测序与2016年相同。测序数据已提交至NCBI SRA档案（登录号：PRJNA624184）。
总RNA提取根据制造商的说明，使用 TRIzol 试剂（Invitrogen，美国）从四个阶段（G、R、C 和 P）、根、茎、叶和子叶组织的中果皮样品中提取总 RNA。通过 NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) 测量总 RNA 浓度和纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳测定总 RNA 整合和质量。然后，通过无RNase DNase I（TaKaRa，大连，中国）去除基因组DNA，并将总RNA溶解在无RNase的水中（天根，北京，中国）。用于降解组测序的样本由等量的四阶段样本组成，以获得足够大的样本。
小 RNA 文库和降解组文库构建和测序总 RNA 样品（G、R、C 和 P）被送到上海个人生物技术有限公司（中国）构建小 RNA（sRNA）文库。然后使用Illumina NextSeq 500测序系统进行单端测序。
为了构建用于降解组测序的 cDNA 文库，使用 poly-T 寡聚磁珠（Roche，USA）和两轮纯化从果实总 RNA（20 μg）中纯化 poly(A) RNA。因为 mRNA 的 3' 切割产物含有 5'-单磷酸，所以 5' 接头通过 RNA 连接酶连接到 mRNA 3' 切割产物的 5' 末端。使用 3' 接头随机引物进行逆转录以制备 cDNA 的第一条链，并使用 AMPure XP 珠子（贝克曼，美国）进行大小选择。然后，在以下条件下用PCR扩增cDNA：95℃初始变性3分钟；98℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，15个循环；最后在 72°C 下延伸 5 分钟。最终 cDNA 文库的平均插入大小为 200-400 bp。最后，我们按照供应商推荐的方案在 Illumina HiSeq 2500 上进行了 50 bp 单端测序。小RNA文库的原始数据提交给NCBI SRA（Short-Read Archive）数据库（登录号：PRJNA624184）。
数据分析和检索为了分析 miRNA 测序数据，首先过滤原始数据以修剪测序接头并去除低质量读数。然后，对长度在 18 nt 和 36 nt 之间的读数进行计数，并去除相同的读数以获得独特的读数。Rfam 11 数据库用于通过对数据库进行独特的读取来识别核糖体 RNA (rRNA)、转移 RNA (tRNA)、小核 RNA (snRNA) 和小核仁 RNA (snoRNA) 44。与四种 RNA 不匹配的读数用于下一步分析。这些读数针对成熟的甜瓜 miRNA 序列（miRBase 21，http://www.mirbase.org/）进行爆炸，以鉴定已知的保守 miRNA 45. miRNA 的表达通过每百万读数 (CPM) 进行标准化。DESeq（版本1.18.0）软件用于计算miRNA差异表达46。miRNA 的临界值是 log2|fold change|> 1 和p值 < 0.05。分层聚类和热图由 pheatmap 包（版本 1.0.12，Raivo Kolde）在 R 中执行。计算欧几里得距离，使用完全连锁进行聚类。PsRobot 用于预测 miRNA 目标，默认设置为47。miRNA 前体的二级结构由 mFold（3.5 版）48预测。为了鉴定甜瓜果实中表达的新型 miRNA，Mireap ( https://sourceforge.net/projects/mireap) 使用默认设置，软件根据预测的新 miRNA 候选顺序命名新 miRNA，并且还研究了最小自由能 (MFE) 和 MFE 指数 (MFEI) 49。MFEI 可以很容易地用于将 miRNA 与其他非编码和编码 RNA 区分开来，因为大多数 miRNA 前体的 MFEI 大于 0.85。为了更精确地预测新的 miRNA，新的 miRNA 注释遵循植物 miRNA 注释的修订标准50。转录组数据（SRA 登录号：PRJNA543288）来自 SRA 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）。
对于降解组测序数据分析和目标基因确定，原始数据通过 FastQC 进行修剪以获得干净的读数。ACGT101-DGD (3.1)、CleaveLand 和 Target Finder 软件用于后续分析51。读数被映射到甜瓜 cDNA 以生成降解组密度文件。通过Target Finder软件预测目标mRNA，并将结果与降解组密度文件进行比较以确定共预测的mRNA。T-plot 用于显示 miRNA 的目标 mRNA 52。miRNA的靶基因由降解组类别和T图的P值确定。为了获得更严格的结果，降解组类别 0、1 和 2 的基因与P保留 <0.05 的值用于以后的 miRNA 靶基因分析。mRNA 目标基因本体 (GO) 分析由 Metascape ( http://metascape.org/ ) 53 进行。
图 1：小 RNA 独特读数的注释和保守 miRNA 表达谱的热图。a十二个文库的 Small RNA 独特读数的注释。b保守miRNA的表达谱和聚类。miRNA后面的字母表示具有相同成熟miRNA序列的miRNA的同源物。G 生长阶段，R 成熟阶段，C 更年期，P 更年期后阶段
表 1 新型 miRNA 表
图 3：miR393 的新型 miRNA 序列比对、靶基因 GO 富集和靶基因分析。
a cme-m1429 和 cme-miR399 家族成员的序列比对。保守序列以蓝色显示。b保守miRNA靶基因的GO富集。相同颜色的富集GO词条表示同一个簇，节点的大小代表落入该词条的输入基因数。cme-miR393靶基因的c T图。红线表示目标基因的切割位点。d甜瓜和拟南芥TIR1/AFB 家族基因的系统发育分析
图 4：甜瓜 TIR1/AFB 家族基因的表达。G生长阶段，R成熟阶段，C更年期，P后更年期。不同的基因以不同的颜色显示；误差棒代表三个生物学重复的平均值±SD
转基因甜瓜植物系的产生使用特异性引物（补充表4）扩增cme-miR393a序列（pre-miR393a）的发夹序列，并将该片段在35S启动子的转录控制下克隆到pPZP221载体中。然后通过花粉管途径将构建体引入野生型河套甜瓜植物中54。使用特异性引物通过PCR选择转化植物以确认转基因品系中存在T-DNA插入物。获得了三个以上的独立系。如前所述，在温室中种植转基因品系，并对 T1、T2 和 T3 代进行果实表型观察、果实可溶性固形物含量和硬度。
图 5：cme-miR393 过表达转基因株系的表型和表达分析。a转基因品系和非转基因甜瓜果实成熟天数的比较。误差棒代表 3 个转基因品系的 ± SD，每个品系重复 10 次。b非转基因和转基因品系的果实。非转基因果实成熟时收获的果实（43 DAP）。比例尺 = 5 厘米。c果实成熟期中果皮中cme-miR393的相对表达量。d果实成熟期中果皮中CmAFB2的相对表达量。数据代表三个生物学重复的平均值±SD。CK：非转基因甜瓜果实对照组；17-2、67-3、69-1：cme-miR39 3 过表达转基因株系的果实（学生t检验；*p < 0.05；**p < 0.01）
定量实时 PCR 分析进行定量实时 PCR (qRT-PCR) 测定以验证 miRNA 表达。总 RNA 使用 oligo (dT) 引物和 Mir-X miRNA 第一链合成试剂盒（TaKaRa，大连，中国）进行逆转录。根据制造商的建议，用于 miRNA 的 qRT-PCR 验证的 5' 正向引物包括成熟 miRNA 的完整序列，并且用于 qRT-PCR 的 3' 引物随试剂盒一起提供。U6 小核 RNA 用作内部对照。引物列于补充表4 中。定量RT-PCR使用SYBR执行®预混防爆的Taq™II（TAKARA，大连，中国）和96孔Chromo4实时PCR系统（Bio-Rad公司）。qRT-PCR 条件如下：95 °C 预变性 30 s，然后是 40 个循环，95 °C 5 s，60 °C 30 s。
使用 SYBR® Premix Ex Taq™ II（TaKaRa，大连，中国）和 96 孔 Chromo4 实时 PCR 系统（Bio-Rad）进行 miRNA 靶基因分析的定量实时 PCR。GAPDH用作内部对照基因。qRT-PCR 条件如下：95 °C 预变性 30 s，然后是 40 个循环，95 °C 5 s，60 °C 30 s。delta-delta Ct方法用于分析miRNA和mRNA的表达水平。
图 2：不同甜瓜组织和果实发育阶段保守 miRNA 和新型 miRNA 的 qRT-PCR 验证。DAP 授粉后天，9 个 DAP 果实的 9 DAP 中果皮，27 个 DAP 果实的 27 DAP 中果皮，G 生长阶段，R 成熟阶段，C 更年期，P 雨后阶段。条形表示来自 qRT-PCR 结果的 miRNA 丰度。实验在三个生物学重复中进行。误差棒代表三个生物学重复的平均值±SD
