westernblot实验步骤（WesternBlot实验小技巧）
westernblot实验步骤（WesternBlot实验小技巧）SDS-PAGE电泳注意事项：A280法：操作简单，蛋白质中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸在280nm处吸光值来估测蛋白质的含量，buffer离子，核酸，乙醇等，其中尤其以核算的影响最为严重。在碱性环境下蛋白质与二价铜离子综合并将二价铜离子还原为一价铜离子，该复合物在562nm处有较高的吸光值，BCA方法可兼容高达5%的SDS，TritonX-100以及Tween等。如果溶液中含有与铜离子反应的螯合剂，比如EDTA或者还原性试剂，比如DTT，β-巯基乙醇，结果将受到很大程度的影响。Bradford法：带负电的考马斯亮蓝燃料与蛋白质碱性氨基酸相互作用，在595nm处有吸收峰，高浓度去垢剂影响Bradford方法最大兼容浓度威0.125%；Tween-20（80），最大兼容浓度0.061%；咪唑（PH7.0），最大兼容浓度200mM，兼容还原性试剂。
Western Blotting广泛用于特定组织/细胞中目标 蛋白是否出现及其量变、位移等分析，是实验室 里最常用的蛋白分析平台。但由于其中技术环节较多，获得稳定一致、高质量的结果也并非易事。接下来，我们一起来分析一下WB实验中的常见头疼小问题吧：
Western Blot原理
蛋白浓度测定常用方法：
BCA方法：
在碱性环境下蛋白质与二价铜离子综合并将二价铜离子还原为一价铜离子，该复合物在562nm处有较高的吸光值，BCA方法可兼容高达5%的SDS，TritonX-100以及Tween等。如果溶液中含有与铜离子反应的螯合剂，比如EDTA或者还原性试剂，比如DTT，β-巯基乙醇，结果将受到很大程度的影响。
Bradford法：
带负电的考马斯亮蓝燃料与蛋白质碱性氨基酸相互作用，在595nm处有吸收峰，高浓度去垢剂影响Bradford方法最大兼容浓度威0.125%；Tween-20（80），最大兼容浓度0.061%；咪唑（PH7.0），最大兼容浓度200mM，兼容还原性试剂。
A280法：操作简单，蛋白质中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸在280nm处吸光值来估测蛋白质的含量，buffer离子，核酸，乙醇等，其中尤其以核算的影响最为严重。
SDS-PAGE电泳注意事项：
1.浓缩胶的目的是使Loading的样品能够在同一条水平线上进入分离胶，理论上分离胶电泳时低电压长时间分离效果会更好，浓缩胶80V分离胶150V就能跑的比较好，同时制胶前一定要使胶混匀，双蒸水隔离时，一定要比较轻的加上去，避免稀释上层的分离胶，使胶不均匀。
2.所有的蛋白样品定量一致，体积一致，不够的用裂解液补足，样品两侧的泳道用等体积的1×Loading Buffer 上样，Marker也用1×Loading Buffer调制与样品等体积，这样可以避免最边上孔道电泳时出现扩散，使两侧孔道的电泳出现误差。
3.Western-Blot一般上样量30~100μg不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一抗、二抗的量和孵育时间都有关系，也与显色时间长短有关系，开始摸索条件时，为了得到阳性结果，各个步骤都可以量多一点，时间长一点。
印记膜的选择：
封闭试剂的选择：
脱脂奶粉：比较受欢迎，经济实惠，易于制备，脱脂奶粉时许多种蛋白质的混合物，但是如果你的蛋白是磷蛋白的话，不要选择脱脂奶粉，会有很多的背景信号。
BSA：牛血清蛋白是牛血清中提纯后的一种球蛋白，但是一些BSA制剂中含有酪氨酸磷酸化蛋白，如果使用抗酪氨酸的抗体，会干扰检测。
商品化封闭剂：这种封闭剂的好处就是了以确定里面不含有磷蛋白、免疫球蛋白、白蛋白、生物素等其他封闭剂中难以避免的成分，价格相对较高。
发光液的选择：
不同的底物，实现不同的显色方法。
·生色底物（Colormetirc/Chromogen）
HRP（Horseradish Peroxidase ）： HRP底物显色是利用底物（DAB-二氨基联苯胺等）在有 HRP和过氧化氢的存在下失去电子而呈 现出褐色不溶性沉淀产物于膜上积累；
AP （Alkaline Phosphatase）：AP底物显色是利用底物（BCIP/NBT-5溴4氯3吲哚基磷酸盐）在有AP存在下生成蓝紫色沉淀产物于膜上积累；
·化学发光底物（Chemiluminescent）
HRP：HRP在H2O2存在下，氧化化学发光物质Luminol生成邻苯二甲胺的激发态 当激发态复合物返回基态时，将放出428nm的蓝光；
AP：DioxetanePhosphate是AP的化学发光底物；
选择灵敏度更高的HRP底物，获得更好的数据，带来三重效益：更佳的结果，更快，更便宜。
Western Blot转膜技巧：
对于转膜有很多的方法，常见的有干转和湿转。
但是转印的时间都是很久的，而且一次性转印的数量也是有限的，多则4小时，少则两小时，现在有一个神奇的设备可以快速高效的完成Western Blot的蛋白转膜。
那么如何解决这个难题：
天能VE-586
同时转印四块凝胶
时间节约一半
效率大大提高
最关键的是安全
性能特点
- 可同时转印四块9×9cm凝胶
- 转印时间为15-60min
- 槽体高强度，免除液体渗漏的困扰
- 专用开启式转移胶架，操作方便
- 多重安全设计，解决操作安全问题
下面，让我们看一下实验中出现的一些小问题以及对应的解决策略:
解决了这些问题，还用担心你的WB实验不完美嘛？解决科研顽疾，分分钟搞定实验数据！
昆明纳瑞科技有限公司
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