trna在细胞的哪里（Treg细胞的未来CAR-Treg）

trna在细胞的哪里（Treg细胞的未来CAR-Treg）Treg分泌抑制性细胞因子（包括 IL-10、TGF-β 和 IL-35）。Treg细胞主要有以下五种功能机制：调节T细胞的分类和功能Treg细胞是T细胞的一种，占CD4 T细胞总数的5~10%，具有维持体内平衡和预防自身免疫的功能，其特征是CD4 CD25 FOXP3和低水平CD127的共同表达。高水平的FOXP3和特异性去甲基化区域（TSDR）的去甲基化是Treg的显著特征，TSDR是FOXP3基因中的一个保守区域。Treg细胞分两类：天然调节T细胞（nTreg）和诱导调节T细胞（iTreg）。两类Treg都表达Foxp3。nTreg在胸腺中发育，通过细胞间接触实现抑制作用，功能是维持正常免疫耐受和控制炎症反应。iTreg来源于肿瘤微环境信号诱导的外周原始T细胞，包括肿瘤抗原、细胞因子（如IL-10 TGF-β）和其他可溶性分子。iTreg通过促进肿瘤进展的机制来抑制效应T细胞（Te

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细胞名称：调节T细胞（Regulatory cell）

，简称Treg细胞。Treg 细胞在免疫系统功能中扮演的是迷人又可爱的反派角色。

调节T细胞（Treg）是免疫细胞的一小部分，主要功能是抑制过度免疫激活和维持免疫稳态。在过去20年中，嵌合抗原受体（CAR）和基因编辑技术的发展，促进了T细胞治疗的优化。CAR技术被用于增强Treg细胞的特异性和功能性 Treg细胞治疗正得到快速的发展。

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调节T细胞的分类和功能

Treg细胞是T细胞的一种，占CD4 T细胞总数的5~10%，具有维持体内平衡和预防自身免疫的功能，其特征是CD4 CD25 FOXP3和低水平CD127的共同表达。高水平的FOXP3和特异性去甲基化区域（TSDR）的去甲基化是Treg的显著特征，TSDR是FOXP3基因中的一个保守区域。

Treg细胞分两类：天然调节T细胞（nTreg）和诱导调节T细胞（iTreg）。两类Treg都表达Foxp3。nTreg在胸腺中发育，通过细胞间接触实现抑制作用，功能是维持正常免疫耐受和控制炎症反应。iTreg来源于肿瘤微环境信号诱导的外周原始T细胞，包括肿瘤抗原、细胞因子（如IL-10 TGF-β）和其他可溶性分子。iTreg通过促进肿瘤进展的机制来抑制效应T细胞（Teff）、NK细胞和DC细胞的抗肿瘤免疫作用。

Treg细胞主要有以下五种功能机制：

• Treg分泌抑制性细胞因子（包括 IL-10、TGF-β 和 IL-35）。

• Treg通过颗粒酶和穿孔素杀死效应细胞。

• Treg影响效应细胞的功能：Treg与效应T细胞竞争消耗 IL-2，从而抑制效应T细胞的生长；Treg通过产生胞外酶CD39和CD73促进TME中腺苷的产生，诱效应细胞导的抑制和抗增殖作用；Treg通过缝隙连接将大量cAMP转移到效应T细胞，干扰其代谢。

• Treg通过刺激性和抑制性受体（CTLA-4 或 LAG3）诱导DC耐受，后者通过IDO进一步抑制T细胞的能力。

• MDSCs和Treg产生的因子形成正反馈环，促进增殖，增强抑制环境。

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调节T细胞：从多克隆到抗原特异性

最初，Treg过继性疗法的临床试验，主要使用多克隆或体外扩增的Treg。第一份使用经体外扩增的Treg治疗GVHD的研究报告表明，慢性GVHD患者症状得到缓解，并可能减少免疫抑制剂的使用。几年后，11名接受造血干细胞移植治疗恶性血液病的GVHD患者，使用扩增后的脐血Treg细胞治疗，发现患者II-IV级急性GVHD的发病率降低5倍，Treg治疗组一年后无慢性GVHD，而对照组为14%。

Treg细胞治疗获得了令人鼓舞的临床效果，但是细胞数量大是个问题。此外，Treg还有非特异性免疫抑制的风险。这些缺点可以通过使用抗原特异性Treg来克服，与多克隆Treg相比，抗原特异性Treg只需要较少的细胞就可以实施更多的局部和靶向抑制。研究证明，在动物模型中，特异于所需抗原的Treg在功能上优于多克隆或未修饰的Treg。

传统的产生抗原特异性Treg的方法，主要依赖于用APC和特异性抗原扩增，或用TCR-Treg。然而，用APC扩增Treg效率低下，而TCR-Treg仍然受到MHC的限制，限制了针对不同患者的模块化应用。

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如何设计一个CAR-Treg

CAR-Treg是治疗自身免疫性疾病的一种策略。与TCR-Treg相比，CAR具有独特的优势：表达CAR的T细胞激活时，绕过HLA限制；通过共受体信号的激活增加了特异性；CAR的靶向灵活性（任何可溶性或表面多价抗原都可以作为靶点）。

CAR-Treg细胞最直接的应用是GvHD和器官移植排斥反应。与大多数自身免疫性疾病不同，器官移植中有非常明确的靶点（即HLA分子）。2016年，首次报道了HLA-A2 CAR-Treg细胞。研究证明，HLA-A2-CAR-Treg细胞抑制Teff细胞增殖，并在免疫缺陷NSG小鼠模型中阻止了HLA-A2 PBMC介导的GVHD。

CAR-Treg细胞新的应用方向仍在出现，B细胞靶向抗体受体Treg细胞（即BAR-Treg）是研究热点。人VIII因子（FVIII）注射液用于治疗A型血友病患者，而随着时间的推移，抗FVIII中和抗体的发展会导致发病率和死亡率上升。含有FVIII免疫显性结构域（A2或C2）作为胞外结构域的BAR被设计成靶向FVIII特异性B细胞 细胞内信号结构域仍为CD28-CD3ζ。

引人注目的是，在体外，展示A2结构域或C2结构域的人BAR-Treg细胞抑制了用重组FVIII免疫的小鼠产生抗FVIII抗体。

CAR-Treg另一个重要方向是共刺激领域的选择。目前使用的共刺激域与传统CAR-T细胞中使用的相同。虽然传统T细胞和Treg通常表达相同的共刺激受体，但细胞内的信号不同，导致不同的效应器功能。

到目前为止，大多数CAR-Treg的共刺激域是4-1BB或CD28。最近，人们研究了具有10个不同共刺激结构域（例如CD28、CD28 Y173F、ICOS、CTLA-4、CTLA-4 Y165G、PD-1、4-1BB、GITR、OX40、TNFR2）的第二代CAR-Treg，当测试功能和基因表达谱时，表明CD28共刺激信号传递更优越。使用4-1BB或TNFR2会导致Treg稳定性和功能下降。

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CAR-Treg在自身免疫性疾病的妙用

▉ 移植物抗宿主病

Treg治疗已成为GVHD研究的重要领域，主要集中于经体外扩增的Treg。治疗GVHD首次临床试验显示，Treg对急性GVHD症状影响不大，但显著缓解了慢性GVHD的症状，并减少了免疫抑制剂的使用。

CAR-Treg，是一种同种抗原特异性人类Treg，被设计用于表达HLA-A2-特异性CAR。在体外和体内试验中，A2-CAR-Treg保持FoxP3、CD25、Helios和CTLA-4的高表达。此外，研究者在免疫缺陷小鼠模型中预防了异种GVHD。继HLA-A2靶向CAR-Treg成功后，最近的研究重点是产生具有不同靶向结构域（如CD83）的CAR-Treg，可在小鼠模型中预防GVHD。还有CD19，其可抑制B细胞抗体的产生和导致GVHD的病理学。

在英美等国，开展世界上第一次CAR-Treg用于缓解肾脏移植的临床试验（NCT04817774）。这项试验可能支持CAR-Treg在临床试验中优于扩增的Treg，进一步扩大在其他疾病条件下使用CAR-Treg的可能性。随后，Quell Therapeutics，专注于肝移植受者的CAR-Treg。

▉ 1型糖尿病

1型糖尿病（T1D）是自身免疫性疾病，其特征是由于胰腺β细胞的破坏而导致胰岛素绝对缺乏。研究表明，T1D患者中Treg细胞免疫抑制功能降低。在动物模型中，输注扩增的抗原特异性Treg在阻断和逆转糖尿病方面显示出有积极的结果。

研究重点是用FoxP3基因转导的CD4 T细胞，将其转化为Treg。此外，可通过工程化TCR或CAR技术将抗原特异性赋予多克隆T细胞。Brusko的研究小组发现，谷氨酸脱羧酶（GAD）特异性TCR转导的Treg在体外可以抑制抗原特异性T细胞增殖的能力。

另一项研究中，Hull等人将胰岛特异性TCR转移到Treg细胞，并证实其在体外具有抑制CD4 T和CD8 T细胞增殖的能力。目前，GentiBio和Abata等公司正在开发TCR-Treg治疗T1D。

▉ 类风湿性关节炎

类风湿性关节炎（RA）是最常见的炎性关节炎，其特征是滑膜炎症、增生、自身抗体产生、软骨和骨破坏。多种免疫细胞亚群参与RA的发展，其中，T细胞和巨噬细胞之间的相互作用起着至关重要的作用。

Wright等人利用卵清蛋白（OVA）特异性Treg，通过产生TCR-Treg或TCR-FoxP3转导的CD4 T细胞，来抑制OVA诱导的关节炎。两种TCR-Treg均通过旁观者抑制对不同抗原特异性T细胞的增殖表现出OVA依赖性的抑制。目前，Sonoma Biotherapeutics公司正在开发针对RA的CAR-Treg疗法。

▉ 多发性硬化症

多发性硬化（MS）是自身免疫性脱髓鞘和神经退行性疾病，由识别髓鞘表位的自身反应性T细胞引起。使用自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型进行的临床前研究，证实Treg抑制抗原特异性自身反应性免疫反应的有效性。

Fransson等人用CAR靶向髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）创建抗原特异性Treg。在体外实验，MOG-CAR-Treg抑制了效应T细胞的增殖。在体内实验，MOG-CAR-Treg减少了EAE小鼠的疾病症状，并减少了脑组织中的促炎细胞因子mRNA水平。

Kim等人利用源自MS患者的髓鞘碱性蛋白特异性TCR构建了Treg，在体内TCR-Treg显著降低了EAE-MS小鼠模型中的疾病评分。免疫调节工程化Treg在临床前研究中的结果，促进了一些生物制药公司的CAR-Treg的开发（如Abata Therapeutics和TeraImmune）。

▉ 炎症性肠病

炎症性肠病（IBD）是以胃肠道慢性炎症为特征的疾病，溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）是IBD最常见的形式。研究表明，肠道微生物群和免疫反应的不平衡在IBD中起重要作用。通常，肠道炎症与Treg数量的减少无关。然而，Treg活性不足的小鼠更容易发生严重结肠炎。因此，多项研究试图利用Treg抑制活性来维持UC的耐受性。

在一项小鼠研究中，针对结肠炎抗原（TNP）的CAR-Treg在体外抑制了效应T细胞的增殖。在体内，诱导结肠炎后，与野生型相比，观察到CAR-Treg转基因小鼠的存活率增加。此外，将TNP-CAR-Treg转移到结肠炎小鼠模型中可以减少症状并提高存活率。基于CAR-Treg细胞的治疗可能是缓解UC和CD的一种有前途的有效方式。

▉ 哮喘

哮喘是慢性呼吸道疾病，哮喘患者的Treg受损并减少。因此，新方法专注于通过在哮喘临床前模型中转移Treg来预防气道炎症。

此外，利用Treg表位（Tregitopes）诱导高度抑制性过敏原特异性Treg。用Tregitopes治疗可抑制过敏原诱导的气道高反应性和肺部炎症。为了将Treg导向哮喘相关抗原，Skuljec等人应用CAR技术，从转基因小鼠中分离出针对CEA的第二代Treg，CEA是一种存在于肺和胃肠道腺上皮表面的糖蛋白。结果显示：哮喘小鼠炎症肺中CEA-CAR-Treg的激活和归巢。此外，与未修饰的Treg相比，CEA-CAR-Treg改善了炎症。

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下一代CAR-Treg

与TCR-Treg相比，CAR-Treg具有独特的优势：表达CAR的T细胞激活时绕过HLA限制，通过共受体信号的激活增加了特异性，以及CAR的靶向灵活性。

▉ 合成生物学

治疗自身免疫性疾病的Treg细胞药物的开发，不仅仅局限于TCR和CAR的应用，合成免疫学已经产生了许多人工受体和系统，正在Treg细胞中进行测试。这些系统包括通过连接的单链抗体将内源性TCR复合物招募到非MHC靶点的T细胞抗原偶联剂，可以被可溶性配体结合并激活的CARs，以及可分开的、通用和可编程的CAR（SUPRA）。

▉ 细胞因子

毫无疑问，细胞因子在免疫反应中起着关键作用。Treg细胞表达IL-2受体的高亲和链CD25，有效地剥夺Teff细胞的IL-2。此外，通过CAR-Treg细胞的改造，可以将促炎细胞因子信号转化为IL-2或IL-10信号以增加对炎症的抑制。

▉ 基因编辑

利用CRISPR–Cas9编辑人类T细胞基因的临床前研究，包括敲除CD4 T细胞中CCR5的基因，产生抗HIV感染的T细胞；敲除CD7-CAR T细胞中CD7的基因，因为T细胞本身表达CD7，从而防止自相残杀；以及敲除CD19-CAR T细胞中PD1的基因，从而提高人源化小鼠模型的肿瘤清除率。

▉ 提升递送系统

目前，CAR-T细胞的制造，使用逆转录病毒和慢病毒转导将遗传物质传递并整合到T细胞中。费时、昂贵且有安全，是个很大困扰。

非病毒的递送方法正在开发中，例如CRISPR-RNPs共电转，可以将超过1kb的DNA敲入人T细胞的特定基因组位点，这简单，安全，双链DNA模板没有毒性。这种方法，纠正了单基因自身免疫性疾病患者细胞中的致病性CD25突变，证明了其潜在的应用价值，缺点是受到插入片段大小的限制。

▉ 细设计Treg细胞

Treg细胞治疗面临的障碍是确保细胞在输注后的存活。利用基因编辑敲除Treg细胞中JNK1基因可使其抗凋亡，JNK1缺陷的Treg细胞分泌更高水平的IL-10和TGFβ ，可以保护移植胰岛不受排斥反应的影响比对照延长100天。

此外，Treg细胞在炎症环境中也可能变得不稳定，并转化为致病性Th17细胞。通过敲除PRKCQ基因，可以降低了Treg细胞向Th17细胞分化的倾向，同时保持了Treg细胞的抑制功能。

最后，通过基因编辑获得低免疫原性人多能干细胞，再加上不断的努力将干细胞分化为Treg细胞，这可能会彻底改变工程化Treg细胞治疗的手段。

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文末小结

目前，Treg细胞治疗自身免疫性疾病正方兴未艾，CAR-Treg表现出独特的优势，具有极大的潜力。然而，在Treg细胞生物学和Treg细胞治疗领域仍存在许多问题。

在接下来的十年中，随着这些悬而未决的问题的解决，期待看到Treg细胞制造的持续改进，以及与合成生物学和基因编辑的广泛应用，将使Treg细胞疗法发挥出越来越重要的作用。

参考文献：

1. The Future ofRegulatory T Cell Therapy: Promises and Challenges of Implementing CARTechnology. Front Immunol. 2020; 11: 1608.

2. Chimeric AntigenReceptor (CAR) Treg: A Promising Approach to Inducing Immunological Tolerance.Front Immunol.2018 Oct 12;9:2359.

3. Next-generation regulatory T cell therapy. Nat Rev Drug Discov. 2019 October ; 18(10): 749–769.

4. Chimeric Antigen Receptor (CAR) Regulatory T-Cells in Solid Organ Transplantation. Front Immunol.2022; 13: 874157.

5. CAR-T Regulatory (CAR-Treg) Cells: Engineering and Applications. Biomedicines.

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