模拟酸雨对生物的影响实验步骤（论文推荐模拟酸雨对小黑杨幼苗生长和光合特性的影响）

小君 2023-04-16 11:23:12 520

模拟酸雨对生物的影响实验步骤（论文推荐模拟酸雨对小黑杨幼苗生长和光合特性的影响）作者简介下面跟学报君一探究竟！1.东北林业大学生命科学学院；2.东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室。对于植物而言酸雨已成为常见的非生物胁迫之一不同的植物对于酸雨胁迫的响应不同，当酸雨的酸度超过植物的耐受极限时植物叶片会出现变黄、脱落、衰老甚至死亡等现象。更多的研究表明植物通过调整体内生理生化过程应对酸雨胁迫表现出一定的耐受性。光合作用是植物体内重要生理过程电子传递过程中容易受逆境胁迫而产生过剩的活性氧一部分活性氧被活性增强的抗氧化酶消除一部分则与植物细胞内的抗氧化物质［维生素E(VE)、维生素C(VC)]结合。而过剩活性氧可能会破坏光合机构常表现为光能利用率下降和光合电子传递受阻等造成植物光合能力减弱。研究发现:重度酸雨(pH ≤3.5)处理的桑树(Morus alba)叶片光系统Ⅱ活性和电子由QA到QB传递受阻;而适度的酸雨胁迫(pH ≥4.5)可促进桑树叶片瞬时净

原创张濛等南京林业大学学报

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论文推荐

模拟酸雨对小黑杨幼苗生长和光合特性的影响

张濛1，续高山1，滕志远1，刘关君2，张秀丽1*

1.东北林业大学生命科学学院；2.东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室。

模拟酸雨对生物的影响实验步骤（论文推荐模拟酸雨对小黑杨幼苗生长和光合特性的影响）(3)

对于植物而言酸雨已成为常见的非生物胁迫之一不同的植物对于酸雨胁迫的响应不同，当酸雨的酸度超过植物的耐受极限时植物叶片会出现变黄、脱落、衰老甚至死亡等现象。更多的研究表明植物通过调整体内生理生化过程应对酸雨胁迫表现出一定的耐受性。光合作用是植物体内重要生理过程电子传递过程中容易受逆境胁迫而产生过剩的活性氧一部分活性氧被活性增强的抗氧化酶消除一部分则与植物细胞内的抗氧化物质［维生素E(VE)、维生素C(VC)]结合。而过剩活性氧可能会破坏光合机构常表现为光能利用率下降和光合电子传递受阻等造成植物光合能力减弱。研究发现:重度酸雨(pH ≤3.5)处理的桑树(Morus alba)叶片光系统Ⅱ活性和电子由QA到QB传递受阻;而适度的酸雨胁迫(pH ≥4.5)可促进桑树叶片瞬时净光合速率缓解光合午休而其光系统Ⅱ电子传递并未受到限制。

小黑杨(Populus simoni x P. nigra)适应能力很强且具有生长迅速、成林早等优良性状在工业用材、植被防护、涵养水源、固碳储碳、改善气候等方面发挥重要作用广泛种植于我国三北地区。目前关于逆境对杨树生长及生理特性的研究多集中在低温、盐胁迫及干旱胁迫等方面。国内关于酸雨对杨树生长影响的研究较少，仅有酸雨对欧美杨南方型‘1-72’杨(Populus x euramericana)的生长及木材化学性质的影响]和白毛杨( Populus x tomentosa)生长及敏感性的报道有关小黑杨保护酶和光系统Ⅱ活性对于酸雨响应情况的相关报道较少。叶绿素荧光技术被称为光合作用研究的探针可无损、快速地反应光合作用过程。因此本期论文推荐的作者以小黑杨幼苗生长指标及叶片结构及部分活性氧、抗氧化物酶和叶绿素荧光参数为研究内容探讨小黑杨对于酸雨的响应状况以期为在酸雨沉降日趋严重的北方地区，合理栽植小黑杨提供理论依据。

下面跟学报君一探究竟！

作者简介

通讯作者

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张秀丽，女，东北林业大学生命科学学院讲师，主要从事植物生理生态研究。

第一作者

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张濛，女，1998年2月生，东北林业大学生命科学学院专业硕士研究生。

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关键词：小黑杨；叶片表型；大气氮硫沉降；超微结构；叶绿素a荧光

基金项目：中央高校基本科研业务费项目(2572017CA21);黑龙江省科学基金联合引导项目(LH2021C009);国家自然科学基金项目( 31600508)。

引文格式：张濛续高山滕志远等.模拟酸雨对小黑杨幼苗生长和光合特性的影响[J].南京林业大学学报(自然科学版) 2021 45(6):55-62.ZHANG M XU G S TENG Z Y et al. Effects of simulated acid rain on growth and pholosynthetic physiological characteristics of Populus simoni x P.nigru[J].Jourmal of Nanjing Forestry University (Natural Sciences Edition) 2021 45(6):55-62.DOI：10.12302/j. issn.1000-2006.202003068.

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1目的

研究小黑杨(Populus simonii × P.nigra)幼苗生长、生理特性和叶片光系统Ⅱ(PSⅡ)活性对酸雨胁迫的响应情况为其在酸雨沉降日趋频发的北方地区栽植提供参考。

2方法

以小黑杨为研究材料对其连续喷施不同酸度pH为2.5 4.5和7.0(CK)]的模拟酸雨待小黑杨叶片出现明显病症时测定其生长、叶片超微结构、抗氧化酶和光系统Ⅱ活性指标。

2.1 试验材料

本研究所用小黑杨(P. simonii ×P. nigra)最早是由中国林业科学研究院林业研究所人工杂交育成。本研究所用小黑杨插条取自东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室实验林场(126°62.87'E 45°71.97'N ) 从同一株小黑杨插条获得的幼苗截顶生根后移至蛭石中浇灌1/2 Hoagland 营养液。试验于2017年4月20日在东北林业大学植物生理室外酸雨棚中进行。

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▲模拟酸雨处理下的小黑杨幼苗

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▲模拟酸雨处理下，小黑杨幼苗株高和叶片表型变化

2.2 试验设计

待杨树苗培养1月左右苗木高生长到30~40 cm时选取长势一致的杨树幼苗进行模拟酸雨处理。试验共设置pH为2.5、4.5和7的清水对照(CK)3个模拟酸雨处理每个处理设5次重复每个重复1株小黑杨。模拟酸雨母液及电解质母液配置参照胡月等方法即以c[NO-3]:c[SO2 4]=3∶1制备酸雨母液利用电解质母液(稀释1 000倍)配置成pH 4.5和 pH 2.5的模拟酸雨溶液。喷施过程中用塑料布将承载小黑杨根系的培养钵覆盖以防止酸雨通过土壤对根系产生影响。考虑小黑杨叶片气孔分布特征对其叶片正反面喷施致液体在叶片成流滴落每天早晚各1次持续喷施3周。当小黑杨幼苗功能叶片出现明显伤斑时进行叶片解剖学观察及荧光动力学曲线、生长和生理指标检测。

2.3 研究方法

快速叶绿素荧光动力学曲线(OJIP)的测定:试验对象为不同处理下长势相对一致的3株幼苗(即3次重复)。试验仪器选择Mini调制式掌上叶绿素荧光仪(FluorPenFP100max 捷克)。首先对小黑杨幼苗顶端往下数第4片叶(完全展开)进行暗处理30 ~ 45 min。然后根据测得的数据绘制0.01 ~1 000 ms的OJIP曲线同时对OJIP曲线进行.JIP-test分析。根据公式以时间为横坐标、相对荧光值为纵坐标分别绘制标准化O-P、O-K、O-J曲线。为使各处理与对照之间的差异更加直观、准确分别将pH 4.5和pH 2.5酸雨处理标准化O-P、O-J和O-K曲线与CK之间作差并分别用∆VO-P、∆VO-J与∆VO-K表示。

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其中:O、L、K、J、I、P点分别代表曲线上0、0.15、0.3、2、30和1 000 ms所对应的荧光强度分别用Fo、FI、FJ、FP、FK和FL表示对应点的相对可变荧光强度;VJ、VI、VK和VL分别是各时间点的相对可变荧光值。

生长指标测定:对已测OJIP曲线对应小黑杨幼苗进行株高、茎粗、叶片数和叶面积测定。株高和茎粗分别利用直尺和游标卡尺进行测定;记录各组小黑杨幼苗的叶片数;并用叶面积仪(Li-3000 美国)测量叶面积。

生理指标测定:利用试剂盒(科铭生物苏州)中分光光度法对超氧阴离子产生速率、过氧化氢(H₂O₂)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性和过氧化氢酶(CAT)活性进行测定。

透射电镜样品制备:分别将切好的小黑杨幼苗叶片样品(1 mm×1 mm×1 mm)用戊二醛和四氧化饿固定液进行前固定与后固定之后利用体积分数50% 、70% 80% 、90% 95% 、100%的乙醇对其进行梯度脱水再经浸透包埋、聚合、修块、定位和染色，利用透射电子显微镜(JEM-2100，日本)对样品进行观察和拍照。

3结果

与对照相比 pH 4.5的模拟酸雨处理下小黑杨株高、茎粗、叶片数和叶面积显著增加;叶片颜色变浅绿色但叶绿体结构紧凑类囊体排列规则未见淀粉粒嗜锹滴数量略增多。而pH 2.5模拟酸雨处理的小黑杨幼苗茎粗和叶面积显著降低;叶片颜色变黄、叶尖和叶脉出现明显斑点且细胞膜局部破损叶绿体体积增大类囊体间隙增大可见少量淀粉粒嗜饿滴数量和体积明显增加。模拟酸雨处理的小黑杨叶片中超氧阴离子产生速率过氧化氢(H₂O₂)含量和过氧化氢酶活性较CK显著增加且酸度越大，增幅越大;而过氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性随酸度的增大表现为先升后降。其中 pH 2.5模拟酸雨处理杨树叶片的可变荧光强度(VL、VK、VJ、VI)和诱导曲线初始斜率(Mo)显著高于CK 但叶绿素荧光曲线面积(FixArea)和质体配库的大小(Sm)显著低于CK。pH 4.5模拟酸雨处理中仅VL和VK显著高于CK 而其他荧光参数与CK差异不显著。

3.1 酸雨胁迫对小黑杨叶片表型及其内部超微结构的影响

模拟酸雨处理下小黑杨幼苗叶片表型及其解剖结构发生了明显变化(图1):对照(CK)小黑杨叶片翠绿(图1 A1) 叶绿体结构完整类囊体排列紧凑内部分布着数量多、体积大的淀粉粒(图1B1、C1)。pH 4.5模拟酸雨处理下小黑杨叶片颜色转呈黄绿色(图1 A2) 但其叶绿体结构完整类囊体排列正常未见淀粉粒可见少数嗜饿滴(图1B2、C2);而pH 2.5模拟酸雨处理下小黑杨幼苗叶片变黄程度加重且叶尖和叶脉出现明显的坏死病斑(图1 A3) 其内部细胞膜局部破裂类囊体片层结构紊乱嗜饿滴颗粒数量和体积明显增多淀粉粒数量少、体积小、色灰暗(图1 B3、C3)。

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▲图 1 模拟酸雨对杨树叶片表型和解剖结构的影响

注：A.叶片;B.细胞;C.叶绿素;Chl.叶绿体; ChM.叶绿体膜;GL.基粒片层;OS.嗜饿滴; SG.淀粉粒; SL.基质片层;CW.细胞壁.A1.对照CK;A2.pH4.5;A3.pH 3.5;B1.对照CK; B2.pH 4.5; B3.pH 3.5; C1.对照组CK;C2.pH 4.5;C3.pH 3.5。

模拟酸雨对小黑杨幼苗生长指标的影响如表1所示。其中 pH 4.5模拟酸雨处理小黑杨幼苗的株高、茎粗和叶片数较CK高出了23.09% (P<0.05)、1.03%(P>0.05)和36.84% (P<0.05) ，叶面积较CK降低了3.18% (P>0.05) ;而在pH2.5模拟酸雨处理下小黑杨幼苗的株高和叶片数较CK变化较小。

▼表 1 模拟酸雨对小黑杨幼苗生长指标的影响

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注:表中数据为均值±标准差不同小写字母表示相同指标在不同处理间差异显著(P<0.05)。下同。

3.2 酸雨胁迫对小黑杨叶片部分氧化和抗氧化指标的影响

模拟酸雨显著增加了小黑杨幼苗叶片的超氧阴离子产生速率过氧化氢(H₂O₂)含量超氧化物歧化酶(SOD) 过氧化物酶(POD)活性和过氧化氢酶(CAT)活性(表2)。pH 4.5模拟酸雨处理下小黑杨幼苗叶片的超氧阴离子产生速率和H₂O₂含量较CK分别增加了30.26% (P<0.05)和72.63% (P<0.05);而其SOD、POD和CAT活性较CK分别升高了15.52% (P<0.05)、37.75%(P<0.05)和366.94% (P<0.05)。pH2.5模拟酸雨处理下小黑杨幼苗叶片的相关指标变化较pH 4.5处理的小。

▼表 2 模拟酸雨对小黑杨幼苗叶片部分氧化和抗氧化指标的影响

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3.3 酸雨胁迫对小黑杨叶片叶绿素荧光动力学曲线（OJIP）的影响

模拟酸雨胁迫改变了小黑杨幼苗叶绿素荧光动力学曲线OJIP曲线的形态(图2)。pH 4.5模拟酸雨处理的Fo、FI、FJ、FP较CK分别升高了18.12% (P<0.05)、13.30% (P<0.05)、9.03%(P<0.05)和9.33% (P<0.05);在pH 2.5模拟酸雨处理下 Fo、FI、FJ、FP较CK分别升高了38.01 %(P<0.05)、20.22% (P<0.05) 、10.17%(P<0.05)和8.21%(P<0.05)。将OJIP曲线进行标准化及标准化后做差发现 pH 4.5模拟酸雨处理下小黑杨幼苗的荧光参数VJ和VI略高于CK，但与CK差异不显著性(P>0.05);而pH 2.5模拟酸雨处理小黑杨幼苗叶片的VJ和VI较CK分别升高了10.26% (P<0.05)和1.67% (P<0.05) 其中 VJ升高幅度大于VI。

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▲图 2 模拟酸雨对杨树幼苗叶片OJIP曲线的影响

注:不同小写字母表示在0.05水平上，相同参数在不同处理间差异显著。下同。

模拟酸雨处理显著提高了小黑杨幼苗叶片L点和K点的可变荧光强度(图3)。其中 pH 4.5模拟酸雨处理下小黑杨幼苗叶片的FL和FK与CK相比分别升高了20.51% (P<0.05)和18.07%(P<0.05) pH 2.5模拟酸雨处理下小黑杨幼苗叶片的FL和FK较CK分别升高了43.22% (P<0.05)和37.11%(P<0.05)。将O-K曲线与O-J曲线标准化后可以发现 pH 4.5模拟酸雨处理小黑杨幼苗叶片的VL和VK与CK相比分别升高了5.31%(P<0.05)和9.85% (P<0.05) ; pH 2.5模拟酸雨处理小黑杨幼苗叶片的VL和VK与CK相比分别升高了12.12%(P<0.05)和21.16%(P<0.05)。

3.4 酸雨胁迫对小黑杨叶片PS Ⅱ光化学活性的影响

不同pH的模拟酸雨处理均使得小黑杨幼苗叶片的最大光化学效率(FV/FM)和以光吸收为基础的光合性能指数(PIABS)显著下降(表3)。在pH 4.5模拟酸雨处理下小黑杨幼苗叶片的FV/FM和PIABS较CK分别降低了2.21% (P<0.05)和23.98%(P< 0.05)。小黑杨幼苗叶片的Q被还原的相对速率(MO)和荧光曲线与FM之间的面积(Fix Area)与CK相比分别升高了12.34% (P>0.05)和6.94%(P<0.05) PSⅡ受体侧的电子受体库容量(Sm)降低了19.54% (P>0.05);在 pH2.5模拟酸雨处理下小黑杨幼苗叶片的FV/FM和PIABS较CK分别降低了5.58% (P<0.05）和52.30%(P<0.05)。小黑杨幼苗叶片的MO、FixArea 与CK相比分别升高了33.51%(P<0.05)和8.48%(P<0.05) Sm降低了24.32%(P<0.05)。