解释凝胶渗透色谱的原理（凝胶渗透色谱的峰加宽效应）
解释凝胶渗透色谱的原理（凝胶渗透色谱的峰加宽效应）2）分子扩散效应柱子直径很大或很小都不容易装得均匀而造成液流的不平滑，出现溶质分子在迁移速度上的差别，为了减少由涡流扩散而造成的谱峰加宽及柱效率的降低，应当用颗粒尺寸小而均匀的凝胶填料，紧密均匀地装在内径适当的柱中。1）涡流扩散效应涡流扩散效应也称“多流路效应"，它与溶液在柱内的流型有关。由于色谱柱内填料凝胶的几何结构不同，造成沿着整个色谱柱长度的流速发生了改变，而流动方向也会因此而不断改变，因此溶质分子在溶液中形成紊乱的类似于涡流的流动。如图所示，溶质分子通过凝胶颗粒时，有的溶质分子所在的流向正对着某个凝胶颗粒，而另外一些分子所在的流向却正好穿过凝胶颗粒之间的空隙。事实上溶质分子并不永远在一条流向上，而在径向上经历许多杂乱无章的速度不同区域，这样溶质分子在某一瞬间围绕填料颗粒运动，而在下一个时刻却因扩散而到填料颗粒之间运动。由于受阻的溶质分子要绕过填料颗粒，因此较直接通过填料颗粒
凝胶渗透色谱峰加宽的现象主要是受两个因素影响：溶液通过凝胶渗透色谱柱所产生的峰加宽和溶液在凝胶渗透色谱柱外产生的峰加宽。前者主要包括与动力学有关的涡流扩散、分子扩散以及流动相中的传质阻力和固定相中的传质阻力等。后者主要是连接管路、进样方式、检测池等因素造成的谱峰展宽。
由于高聚物样品溶液流经凝胶渗透色谱柱所产生的峰加宽通常是由许多扩散作用共同发生作用的结果，所以在凝胶渗透色谱柱中产生的加宽效应比在色谱柱外产生的加宽效应要复杂得多，比小分子溶质的加宽效应则更为复杂。
1.溶液通过色谱柱所产生的峰加宽效应
溶液通过凝胶渗透色谱柱所产生的峰加宽主要与柱填料凝胶的颗粒孔径尺寸大小及装柱技术、柱子的形状构造等有关。但就一根已定型的色谱柱来讲，溶质分子在流经柱内时，其运动行为总会受到各种阻力的影响，这些影响是溶质分子产生峰加宽的内在因素，可以通过研究个别过程的效应，然后将它们加合则可得到总的效应。关于柱内加宽效应的三种因素简介如下：
1）涡流扩散效应
涡流扩散效应也称“多流路效应"，它与溶液在柱内的流型有关。由于色谱柱内填料凝胶的几何结构不同，造成沿着整个色谱柱长度的流速发生了改变，而流动方向也会因此而不断改变，因此溶质分子在溶液中形成紊乱的类似于涡流的流动。
如图所示，溶质分子通过凝胶颗粒时，有的溶质分子所在的流向正对着某个凝胶颗粒，而另外一些分子所在的流向却正好穿过凝胶颗粒之间的空隙。事实上溶质分子并不永远在一条流向上，而在径向上经历许多杂乱无章的速度不同区域，这样溶质分子在某一瞬间围绕填料颗粒运动，而在下一个时刻却因扩散而到填料颗粒之间运动。由于受阻的溶质分子要绕过填料颗粒，因此较直接通过填料颗粒空隙的分子所走的路程要长，从而较后流出色谱柱，因为溶质分子的平均速度决定着保留体积，不同分子在运动速度上的差异便形成了以平均速度为中心的色谱峰加宽。当然，色谱柱中凝胶填料颗粒的大小形状以及填充的不均匀性等，均会使溶质分子所经历的通道各不相同，这也是导致谱峰变宽不可忽视的因素。由此可见，涡流扩散纯属一个流体力学现象，其大小和填料颗粒的形状、尺寸有关。
柱子直径很大或很小都不容易装得均匀而造成液流的不平滑，出现溶质分子在迁移速度上的差别，为了减少由涡流扩散而造成的谱峰加宽及柱效率的降低，应当用颗粒尺寸小而均匀的凝胶填料，紧密均匀地装在内径适当的柱中。
2）分子扩散效应
分子扩散也称“纵向扩散”或“轴向扩散”，它是溶质分子向流动相和固定相反方向的扩散效应，也是溶质分子沿色谱柱轴向扩散的效应，这种轴向扩散在固定相和流动相中都存在，但在固定相中较少，可忽略不计。这种扩散之所以产生是由于柱中存在着浓度梯度的缘故，从而产生了溶质分子的扩散现象。溶质分子在流动相中轴向扩散的结果，破坏了色谱的平衡作用，增大了凝胶渗透色谱柱的理论塔板高度H，并产生了色谱峰的加宽。
3）传质阻力
溶质分子在凝胶渗透色谱柱中所受的传质阻力包括两个方面的内容：一是在流动相中所受的传质阻力，一是在固定相中所受的传质阻力。由于色谱柱中填料颗粒的不均匀性，因而对流动相的影响在截面上的不同位置也有所不同。当柱截面上溶质分子在不同位置上存在有不同的流速梯度时，就会导致溶质分子的浓度梯度。于是就会发生由高浓度相向低浓度相的质量迁移过程，就称之为质量传递，溶质在色谱柱中的质量交换，包括固定相传质CB和流动相传质CM两部分。
流动相传质表示溶质分子从流动相进入两相界面时的质量交换，对任一根GPC柱，流动相在其内的流线总是紊乱的，从而在沿流线和垂直流线的方向上均有流速的变化，这是构成了由于流动而引起色谱峰加宽的基本原因。
固定相中的传质是表示溶质分子从两相界面处进入固定相孔洞之中，并进行质量交换，当达到分配平衡后又重新返回到两相界面的过程。因为每一个被分析的物质在流过色谱柱时都不断地由流动相进入固定相，同时又不断跑出固定相。
在流动相处于静止状态时，样品在固定相和流动相中的浓度分布是界面对称的。如果传质速度极快而流动相流速又很小时，在极限状态下是对称的，此时不会引起峰的加宽。实际上传质速度是有限的，流动相也具有较高的流速，因此不能得到真正的平衡状态，此时传质过程实际是不均匀的。有的溶质分子较早地由固定相中转移到了流动相中，便超前于谱峰的中心区域而形成色谱峰的前沿展宽；有的溶质分子晚些转移则形成谱峰拖尾展宽。这个传质过程是在流动相与固定相之间交替进行着。
在气相色谱中气态样品随载气移动的速度很快，仅仅在固定液薄膜上有影响，而在液相色谱中液体试样是在液态流动相和固定相间进行分离，因此对峰展宽问题就显得更为突出一些。
综上所述，为了减少色谱峰的加宽效应，应当选择直径尽可能小而均匀的微粒凝胶和扩散系数比较大的分离体系，才能最大限度地减少色谱峰的加宽效应。
2.溶液在柱外产生的峰加宽
液相色谱实验技术的最佳化要求定量地分解并尽量地减小发生在柱外的峰加宽过程，即所谓的柱外效应。这对于凝胶渗透色谱也显得特别重要，因为溶质的保留只限于一个相同于柱体积的流动相，在这种情况下只能呈现出一个很窄的峰。然而，柱外效应的存在将降低色谱分离的效能，引起色谱峰的加宽，严重影响分析速度和准确度。
1）进样造成的峰加宽
由于柱外效应，进样亦可能是凝胶渗透色谱中引起峰加宽的一个原因。不论是塞子型或阀型进样，都可以预测由样品注射所造成的峰方差。为了尽量减小由于进样而造成的峰加宽，进样体积一般应限制在不大于第一个有用峰的体积(～4σ)的三分之一。例如以2ml/min(或0.03ml/s）流速时，对于20s宽度的峰，应限制进样量大约在200ul。峰的保留时间越长(k’值越大)，可注射的样品体积也越大。所以对于40s宽度的峰，可最多进400ul的样品体积。这个最大进样体积引起的色谱峰加宽不会使分离度的减小超过大约8%。
进样形式对峰加宽也有一定的影响，在柱入口处可能发生不相等的流线，从而在柱头上造成不平滑的谱带流线，较高线速度的流动相从柱内口的毛细管进入柱中并撞击在柱填料上，所造成的不正常流动结构也会使色谱峰变形。特别是在高流速下操作填装不好，在柱头上有残留锥形空缺的柱子时，这种影响更为突出。为了消除不平滑的样品线速度流线分布，可用点（或中心）注射技术将样品溶液引入柱子。使用这种方法把样品引入到正好通过样品筛板或熔块达柱子顶部中心，而流动相直接穿过整个柱入口截面。这种进样型式等于将-一个尖细的样品脉冲送到柱子中心。当这个脉冲通过柱的中心时，其完整性尚能保持。因此，点注射技术可以保证一种真正的“无限大直径柱”的操作效果，能减小峰加宽效应，并能大大地提高柱效。点注射可用注射器来完成，也可用微型进样阀进样。
2）使用保护柱时造成的峰加宽
保护柱在高效液相色谱中广泛地被采用，用以吸附过滤样品中对分析柱有强保留（不被冲洗）的组分，以延长分析柱的使用寿命。在凝胶渗透色谱中，无论是无机凝胶，还是有机凝胶，为了消除吸附，凝胶表面均进行了化学处理。因此，一般无须采用保护柱。但在很多凝胶渗透色谱实验中，为了扩大分子量分离的线性范围和保持分析结果良好的重复性，往往采用具有相同或不同分子量分离范围的双柱串联或多根柱串联的技术。无疑，由于多根柱串联的结果，会造成谱峰的加宽。特别是对大颗粒凝胶填料柱，多柱串联的结果必然使峰加宽增大，在这种情况下，无论使用单个柱或串联柱，均应进行峰加宽的改正。
串联柱在凝胶渗透色谱中广为使用，柱串联所观测到的方差常常要比单根柱预料的和要大。所以，串联起来的柱子的塔板数似乎要比将单个柱子的塔板数相加所预料的塔板数低。
3）连接管路造成的峰加宽
连接管路系指由进样器到色谱柱和由色谱柱到检测器的这部分管路。这些连接点和相应的管路以及检测器（池体）本身，就构成了色谱系统的柱外体积。一般这些部件之间是用接头螺丝和不锈钢毛细管连接的，如果连接管道过长，特别是凝胶柱和检测器之间的连接管道太长时，由于溶质分子的扩散作用必将导致色谱峰加宽。因此GPC柱外连接的管路应采用尽量细和尽量短的管子，各接头螺丝的死体积应尽量减小，以减少管路对峰加宽带来的影响和确保实验所需的柱效。
4）检测器引起的峰加宽
检测器池的流动性质、它的体积、结构形状的不同都能引起峰加宽效应的发生。发生在检测器中的峰加宽，主要是由于携带溶质的流动相溶剂的紊乱混合及检测池体积的偏大所造成。科学家认为，检测池可以看作为体积一定的容器，溶质分子按尺寸大小进行分离后，在进入检测池后会因突然的体积增大而发生部分大小分子的再次混合，从而造成GPC峰形的改变和加宽效应的产生。科学家发现示差折光检测池的体积若为70ul时，则有明显的分散作用导致的谱峰展宽和对高分子量聚合物溶液产生谱峰分裂现象。因此他们认为示差折光检测池的体积应越小越好，并且不应存在有死角。目前CPC所使用的检测池体积一般为10ul左右，是远小于柱中空体积和连接管路的体积，因而对离聚物溶液的峰加宽效应的影响可以忽略不计。
