离子通道介导的跨膜信号转导系统（膜桥接蛋白复合体介导线粒体氧化应激由内到外的信号转导）
离子通道介导的跨膜信号转导系统（膜桥接蛋白复合体介导线粒体氧化应激由内到外的信号转导）此外，作者发现饲喂氧化剂的dMIC60-WT果蝇中，内源性DMiro和dMIC60的蛋白水平增加。而在dMIC60-CS果蝇中，这种氧化诱导的蛋白质水平上调被阻断了。这说明，dMIC60的氧化促进了它与Miro的相互作用，并稳定了dMIC60-DMiro复合物。作者之前发现内源性的人Miro1能与HEK293T细胞中的MIC60结合。通过共免疫沉淀法(co-IP)发现内源性的果蝇Miro (DMiro)和dMIC60存在于同一个复合物中。dMIC60的氧化还原状态影响其与Miro的相互作用吗？作者发现，在2日龄果蝇中，dMIC60氧化水平较低时，dMIC60与DMiro共免疫沉淀很少；过氧化氢喂养果蝇时，dMIC60和Miro的相互作用增强。此外，作者发现dMIC60-CS果蝇中dMIC60与DMiro结合的能力变弱。这表明，dMIC60的氧化影响其与DMiro的结合。为了探明这种可能性，
线粒体是支持细胞功能和生存的重要细胞器，其活性随着年龄和疾病而下降。线粒体的核心功能是产生ATP，该过程的主要副产物是活性氧（ROS），ROS升高导致氧化应激是多种生理（正常衰老）和病理过程的共同特征。ROS调节生物过程的一个关键机制是蛋白质半胱氨酸残基的可逆共价修饰。氧化半胱氨酸可以在同一蛋白质内部或两个相邻蛋白质之间形成二硫键，引起蛋白质复合物的氧化构象变化。蛋白质结构的氧化还原可以调控大分子复合体的组装、成熟和稳定。
线粒体膜蛋白是线粒体内ROS修饰将氧化还原信号传递到胞质的理想蛋白靶点。线粒体的两层膜紧密相连，被狭窄的膜间间隙(IMS)分隔。位于线粒体内膜(IMMs)和线粒体外膜(OMMs)上的蛋白质复合体可以形成跨双层膜的超复合体。有趣的是，线粒体接触位点和嵴组织系统(MICOS)复合体中的一种成分MIC19/CHCHD3已经被报道以依赖氧化还原的方式调节MICOS的稳定性。本研究作者Xinnan Wang之前已经证明了一种MICOS成分MIC60/Mitofilin与OMM蛋白Miro13在同一复合体中存在相互作用。Miro重要功能之一是将细胞器运动相关蛋白招募到线粒体表面并调节其运动。此外，Miro在启动线粒体自噬，启动组织线粒体内质网接触，平衡细胞内离子、代谢物和类核稳态的线粒体特异性自噬中起着至关重要的作用。IMM蛋白MIC60和OMM蛋白Miro之间的这种连接理论上可以将线粒体内氧化状态的信号转导到胞质中。然而，其中的详细机制有待研究。
2021年9月9日，斯坦福大学医学院Xinnan Wang团队在Nature Metabolism 上发表了题为《A mitochondrial membrane-bridging machinery mediates signal transduction of intramitochondrial oxidation》文章。文章以果蝇为模式动物发现MIC60随着衰老表达上调和IMS结构域的半胱氨酸氧化水平上调，并能通过MIC60-DMiro复合体将线粒体的氧化信号传递给细胞，引起细胞氧化应激，该机制在衰老、帕金森综合征（PD）和弗里德里奇共济失调症等线粒体氧化损伤相关的疾病中发挥作用；通过RNA干扰解聚MIC60-DMiro复合体可以改善细胞氧化，延长果蝇寿命，改善衰老、PD和FA的症状；最后，作者发现了MR3和MR5两种Mrio1小分子抑制剂能改善PD和FA的症状。综上所述，本文发现了MIC60-DMiro是线粒体内氧化信号向胞质转导的新机制，为改善氧化应激相关疾病提供了新的靶点。
人类MIC19蛋白通过在CHCH域的双半胱氨酸-x9-半胱氨酸基序内形成两个二硫键转换成氧化构象。那么半胱氨酸氧化能否引起果蝇中同源的MIC60蛋白构象的改变呢？果蝇MIC60 (dMIC60)有四个半胱氨酸，10号和12号半胱氨酸在预测的线粒体定位信号序列，另外两个（302和550）在dMIC60的膜间区域（IMS），302和550半胱氨酸形成二硫键可能导致dMIC60蛋白折叠。
为了探明这种可能性，作者使用还原剂二硫苏糖醇和非还原剂甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺5000 (PEG-MAL)处理了15天龄果蝇的全身裂解液，二硫苏糖醇可以打开二硫键并线性化蛋白质，使每个半胱氨酸质量向上偏移5 kDa，而不影响氧化的半胱氨酸。蛋白电泳显示，dMIC60蛋白在非还原条件(PEG-MAL)下比还原条件(二硫苏糖醇)下迁移更快，表明dMIC60含有氧化的半胱氨酸，并存在氧化的构象变化。用过氧化氢喂养2日龄的果蝇时，dMIC60在非还原条件(PEG-MAL)下比还原条件(二硫苏糖醇)下迁移更快，表明dMIC60确实被氧化了。
为了证实dMIC60的氧化半胱氨酸形成了二硫键，作者采用了间接硫醇捕获法检测蛋白里的天然二硫键。作者在裂解物中添加三(2-羧基乙基)膦(TCEP)还原二硫键，然后用4-乙酰胺-4 -马来酰二苯乙烯-2，2 -二磺酸(AMS)还原天然二硫键，最终使每个半胱氨酸添加0.5 kDa。作者发现，与对照组相比，15日龄果蝇或2日龄果蝇的dMIC60蛋白带明显上升，证实dMIC60形成了二硫键。用AMS直接处理2日龄的果蝇，其dMIC60条带比用二硫苏糖醇处理的高，没有显示二硫键形成。这些数据表明，dMIC60随着年龄的增长而氧化。
为了证实半胱氨酸302和550之间形成了二硫键，作者构建了302和550半胱氨酸突变为丝氨酸(dMIC60-CS，CS)的转基因果蝇，这样302和550之间就不能形成二硫键。用过氧化氢饲喂dMIC60¬-WT和dMIC60-CS果蝇，然后检测dMIC60蛋白在非还原条件(PEG-MAL)下的迁移，发现氧化的dMIC60-WT比dMIC60-CS迁移得更快；用TCEP处理含有dMIC60-WT的果蝇，然后用AMS捕获形成二硫键的半胱氨酸，这种处理持续导致dMIC60-WT带向上移动。综上所述，我们的结果表明，dMIC60的半胱氨酸302和550形成一个二硫键。
作者之前发现内源性的人Miro1能与HEK293T细胞中的MIC60结合。通过共免疫沉淀法(co-IP)发现内源性的果蝇Miro (DMiro)和dMIC60存在于同一个复合物中。dMIC60的氧化还原状态影响其与Miro的相互作用吗？作者发现，在2日龄果蝇中，dMIC60氧化水平较低时，dMIC60与DMiro共免疫沉淀很少；过氧化氢喂养果蝇时，dMIC60和Miro的相互作用增强。此外，作者发现dMIC60-CS果蝇中dMIC60与DMiro结合的能力变弱。这表明，dMIC60的氧化影响其与DMiro的结合。
此外，作者发现饲喂氧化剂的dMIC60-WT果蝇中，内源性DMiro和dMIC60的蛋白水平增加。而在dMIC60-CS果蝇中，这种氧化诱导的蛋白质水平上调被阻断了。这说明，dMIC60的氧化促进了它与Miro的相互作用，并稳定了dMIC60-DMiro复合物。
氧化应激是正常衰老的标志。上文中作者发现dMIC60氧化水平随年龄增加而上调。那么dMIC60-DMiro复合体在果蝇衰老期间是否发挥氧化还原传感器的作用呢？Mito-Sox染色发现，与年轻果蝇相比，年老果蝇大脑中的线粒体ROS升高。对5日龄幼蝇和50日龄老年果蝇的蛋白组学检测发现，抗氧化酶和应激反应蛋白的上调是老年果蝇蛋白谱的重要特征。Co-IP实验也证明，果蝇中衰老会导致DMiro结合的dMIC60的水平上调；给果蝇饲喂抗氧化剂AD4时，DMiro和dMIC60的结合能力被削弱了。此外，老年果蝇的dMIC60和DMiro蛋白水平也轻度上调; AD4喂养能降低dMIC60和DMiro的蛋白水平。这表明，在衰老过程中，dMIC60氧化上调，增强了dMIC60与DMiro的相互作用以及dMIC60-DMiro复合物的稳定性。
根据上述发现，作者推断，在衰老过程中线粒体内的氧化还原状态可以通过dMIC60的氧化水平和dMIC60-DMiro相互作用发送给细胞，最终导致细胞响应。那么阻断dMIC60-DMiro相互作用或降低蛋白的表达水平能否延长果蝇寿命呢？
作者在dMIC60缺失的果蝇中表达野生型dMIC60或抗氧化突变体dMIC60-CS （dMIC60-CS不能与Miro结合）。作者发现，dMIC60的缺失导致果蝇蛹致死，表达dMIC60- WT或dMIC60- CS能使dMIC60缺失蝇存活到成年，而dMIC60-CS的果蝇的寿命明显长于dMIC60-WT果蝇。此外，作者发现通过RNAi降低神经元中的DMiro水平（而不是肠道肠细胞、肌肉或全身的DMiro水平），可以显著延长果蝇的寿命。在果蝇生命早期或晚期进行DMiro RNAi同样有益。总的来说，这些结果表明dMIC60-DMiro复合体可以作为延长果蝇寿命的靶点。
削弱dMIC60-DMiro的相互作用是否会延长果蝇的健康寿命呢？作者发现，与dMIC60-WT的果蝇相比，dMIC60-CS的果蝇具有更好的运动能力和对抗氧化能力。神经元中的DMiro-RNAi也显著改善了年龄引起的运动能力下降，并提高了果蝇抵抗氧化应激的能力。
综上所述，阻断dMIC60-DMiro复合体的相互作用可以延长果蝇的寿命和健康寿命。
上述研究表明dMIC60-DMiro复合体在延长果蝇的寿命中有重要作用，然而其中的分子机制是什么？作者首先测量ATP水平来确定dMIC60对细胞能量稳态的影响，发现dMIC60-CS组总ATP水平高于dMIC60-WT组；在敲低成年果蝇神经元中dMIC60后果蝇全身ATP和头部ATP水平显著上升。Mito-Sox染色发现，和dMIC60-WT果蝇相比，dMIC60-CS果蝇ROS水平更低；神经元中DMiro-RNAi显著降低了老年果蝇大脑中的ROS水平。这表明dMIC60功能缺失使果蝇的氧化应激得到了缓解。
接下来，作者通过四甲基罗丹明甲酯(TMRM)染色测定了果蝇多巴胺能(DA)神经元中线粒体膜电位（线粒体ATP合成的驱动力），发现老年果蝇大脑的膜电位降低，DMiro RNAi可以改善膜电位，表明DMiro RNAi可以改善年龄的增长引起的线粒体功能受损。在体外对完整的果蝇大脑的seahorse检测发现衰老显著降低了基础耗氧率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)，表明有氧和无氧呼吸都随着年龄的增长而减弱。值得注意的是，在神经元中表达DMiro RNAi可以改善老年果蝇的OCR和ECAR，使其完全恢复到了年轻果蝇的水平。
最后，作者评估了自噬的作用。作者在TH-GAL4驱动的DA神经元中表达Mito-GFP，然后对泛素和自噬启动的关键蛋白p62进行免疫染色。作者发现，与年轻果蝇相比，年老果蝇大脑中与p62共定位的Mito-GFP减少，表明随着年龄的增长，线粒体启动自噬的能力变弱。一致的是，蛋白质组学结果显示，与年轻果蝇相比，年老果蝇线粒体基质蛋白有显著的积累，这可能是自噬受损的结果。有意思的是，DMiro RNAi显著增加了年老果蝇中与p62和泛素共定位的Mito-GFP，这表明DMiro RNAi提高了线粒体自噬效率。
综上所述，解离dMIC60-DMiro复合体可促进细胞呼吸，改善线粒体功能，减轻氧化应激。
ROS是氧化应激相关的重要物质。α-Syn是Lewy小体的主要成分，Lewy小体是帕金森病(PD)的重要病理特征，α-syn的积累会增加线粒体ROS的产生并损害线粒体功能。作者早先发现，野生型α-syn和A53T突变的致病性α-syn的上调会导致Miro蛋白的升高，最终减缓线粒体自噬。
在本研究中，作者观察到表达人α-syn-A53T的果蝇的大脑中ROS水平升高。Co-IP实验表明，和正常衰老的果蝇一样，表达α-syn-A53T的年轻果蝇中dMIC60与DMiro相互作用上调。这表明dMIC60-DMiro氧化还原传感器对果蝇的α-syn毒性有响应。
有趣的是，这两者之间存在时间依赖性。DMiro和dMIC60结合的增加出现(第5天)，随后是DMiro蛋白上调(第15天)和DA神经元丢失(第40天)，提示分子相互作用最终使DA神经元对死亡更敏感。为了进一步确定dMIC60-DMiro与PD的关联，作者在PD20 α-syn果蝇模型中敲除DMiro，发现DMiro敲除可以减轻年龄依赖性的运动能力下降，并保护DA神经元。
线粒体功能障碍导致的氧化应激是许多儿童期线粒体疾病的特征。弗里德里奇共济失调症(FA)是一种早发常染色体隐性遗传疾病，是由编码线粒体定位蛋白(frataxin)的FTX基因GAA重复序列的扩增引起的。该突变减少frataxin蛋白表达并破坏线粒体功能。作者使用frataxin 正交缺陷的FA果蝇疾病模型(Fh)探索了dMIC60-DMiro与FA的关系，发现Fh果蝇大脑中的线粒体ROS水平显著升高。在Fh果蝇的全身裂解液中，DMiro和dMIC60表达上调，结合增加。这表明，氧化还原依赖的dMIC60-DMiro机制在frataxin缺乏时发挥作用。在Fh果蝇中，表达dMIC60-WT会导致成虫全部致死(存活率为0)，而表达dMIC60-CS则不会（成虫存活率为100%)，这表明dMIC60-DMiro复合体在FA发病中发挥作用。
上述研究表明dMIC60-DMiro通路在衰老、PD和FA等多种氧化相关疾病中发挥重要作用，这提示对该通路的药理学干预可能提供一种共同的治疗策略。作者之前已经发现了一些靶向人类Miro1的小分子，并且Miro1抑制剂3、4、5、6(MR3、-4、-5、-6)喂养野生型果蝇会部分降低DMiro蛋白水平。值得注意的是，MR3、MR4和MR5结构相似，这表明它们属于同一类化合物。
为了证实这些小分子可以与Miro1结合，作者在体外使用人类Miro1蛋白和MR3进行了热位移分析，发现MR3引起了Miro1蛋白熔化温度的剂量依赖性下降。这表明MR3直接与Miro1结合。接下来，作者在PD模型中测试了这些小分子，发现MR5治疗显著抑制了PD果蝇的年龄依赖性DA神经元损失和运动能力下降，PD人类神经元模型中也在MR5治疗中获益。在PD患者的iPSC来源的DA神经元测试中，作者发现恰当MR3与MR5治疗可以完全缓解DA神经元的应激性变性。同时，MR3和MR5还能改善FA果蝇的运动能力。这表明MR3/5可能是有一种治疗PD和FA的潜在疗法。最后，作者给野生型果蝇喂食MR3或MR5，发现两种化合物显著延长了果蝇的寿命，MR5还提高了野生型果蝇的ATP总产量。
综上所述，MR3和MR5可以作为缓解多种氧化应激相关疾病的先导分子。
线粒体是产生ROS的主要场所，然而从线粒体基质到细胞胞质的氧化还原信号转导的分子途径尚不明确。本文中作者报道了一个由内而外的线粒体氧化还原信号转导途径。线粒体膜内蛋白MIC60的半胱氨酸氧化，触发二硫键的形成、MIC60与线粒体膜外蛋白Miro的物理结合。两者的结合最终抑制细胞自噬，损伤细胞呼吸，引起氧化应激。阻断MIC60-Miro相互作用或者通过基因或药理学干预降低蛋白表达水平，可以延长健康果蝇的寿命和健康寿命，并对帕金森病和弗里德里奇共济失调的氧化应激相关疾病模型有益。该发现为抗氧化应激的常见治疗策略提供了分子基础。
文/阿司匹林 SHMS
责编/Jane
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s42255-021-00443-a
