视网膜色素变性最新研究进展（碱基编辑遗传性视网膜变性患者的新希望）

视网膜色素变性最新研究进展（碱基编辑遗传性视网膜变性患者的新希望）01.由于 Rpe65功能丧失引发突变，rd12 小鼠表现出早期视锥细胞功能障碍和变性。该团队进一步探索了碱基编辑器是否可以保护视网膜光感受器免于进一步恶化，研究结果显示：近年来，随着RPE65增强疗法临床试验的成功，基因治疗取得了长足进步，最终获得了美国食品和药物管理局的批准。使用腺相关病毒 (AAV) 载体将全尺寸功能拷贝的RPE65转基因递送至患者的RPE细胞的基因疗法，补偿了RPE65功能的丧失，提高了LCA 患者的视力。然而，关于该疗法针对视网膜变性的长期疗效仍然存在争议。治疗数年后，患者经常表现出视网膜变性的持续进展和视力再次下降，这种进行性视网膜变性的原因尚不明确。在该团队之前的研究中，研究人员在名为rd12的LCA2小鼠模型（该模型在RPE65基因的外显子 3 中具有T·A到C·G的无义突变）中证明了碱基编辑策略的使用能够恢复小鼠的视觉功能。碱基编辑器由胞嘧啶碱基编辑器 (

编者按

Leber先天性黑朦症（LCA）是儿童遗传性失明的最常见原因之一，其特征是进行性视网膜变性和视力丧失。LCA 是由负责视网膜和/或视网膜色素上皮 (RPE) 的发育和功能的几个基因突变引起的。RPE65突变的LCA患者表现为视锥细胞功能障碍，导致早期视力损害。因此，开发一种既可以补偿丢失的RPE65功能，还可以防止光感受器进一步退化的治疗方法至关重要。加州大学欧文分校于今年发表的一项最新研究表明，碱基编辑可能为遗传性视网膜变性患者，特别是Leber先天性黑朦症患者，提供持久的视网膜保护，防止视力恶化，这种治疗方法为遗传性视网膜疾病患者带来了新的希望。相关研究结果以“In vivo base editing rescues cone photoreceptors in a mouse model of early-onset inherited retinal degeneration”为题，发表于Nature Communications期刊上。

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初步研究表明：碱基编辑可恢复小鼠的视觉功能

近年来，随着RPE65增强疗法临床试验的成功，基因治疗取得了长足进步，最终获得了美国食品和药物管理局的批准。使用腺相关病毒 (AAV) 载体将全尺寸功能拷贝的RPE65转基因递送至患者的RPE细胞的基因疗法，补偿了RPE65功能的丧失，提高了LCA 患者的视力。然而，关于该疗法针对视网膜变性的长期疗效仍然存在争议。治疗数年后，患者经常表现出视网膜变性的持续进展和视力再次下降，这种进行性视网膜变性的原因尚不明确。

在该团队之前的研究中，研究人员在名为rd12的LCA2小鼠模型（该模型在RPE65基因的外显子 3 中具有T·A到C·G的无义突变）中证明了碱基编辑策略的使用能够恢复小鼠的视觉功能。碱基编辑器由胞嘧啶碱基编辑器 (CBE) 和腺嘌呤碱基编辑器 (ABE) 组成，可将特定DNA碱基对直接转换为另一个碱基对（C·G到T·A，反之亦然）。碱基编辑器独立于Cas9诱导的双链DNA断裂，靶向基因组位点。

进一步研究发现：碱基编辑在LCA2小鼠模型中对视锥细胞丢失具有显著保护作用

该团队进一步探索了碱基编辑器是否可以保护视网膜光感受器免于进一步恶化，研究结果显示：

01.由于 Rpe65功能丧失引发突变，rd12 小鼠表现出早期视锥细胞功能障碍和变性。

小鼠中的视锥细胞被分为两种类型的光检测视蛋白：S-视蛋白和M-视蛋白。rd12小鼠的视网膜上，在3周龄时，S-视蛋白阳性视锥细胞 (S-视锥) 和 M-视蛋白阳性视锥细胞 (M-视锥) 的密度降低，S-视蛋白和M-视蛋白在视锥内节的定位错误。到6周时，几乎所有的 S-视锥都从视网膜平面上消失，而M-视锥仍保留在背侧视网膜中。然而，视网膜横截面显示M-视蛋白定位错误和视锥外段缩短，表明 M-视锥细胞中存在进行性病理过程。基于这些发现，研究人员决定在3周龄的小鼠中进行治疗，此时视网膜已完全发育并且变性过程已经开始，然后从6周龄开始评估治疗后的结果（图1）。

图1

02. 进化的腺嘌呤碱基编辑器提高了体外突变校正率。

虽然腺嘌呤碱基编辑器 (ABE) 和单向导 RNA (sgRNA) 可以纠正rd12突变，但现在研究人员试图通过测试其他三种进化的ABE变体来提高碱基编辑效率，这些变体可以识别更广泛的 protospacer-adjacent基序 (PAM) 序列，即密码子优化的 NG-ABE、xABE 和 NRRH-ABE。两种 sg RNA，即sgRNA-A5 (A5) 和 sgRNA-A6 (A6)，它们分别将突变碱基放置在 protospacer 的第 5 和第 6 个碱基位置。将 ABE 和 sgRNA 的不同组合转染到稳定表达Rpe65rd12 cDNA的细胞系中（rd12细胞系），然后通过深度DNA测序分析碱基编辑结果。测序分析表明，无论ABE类型如何，A5的共转染始终比A6的共转染显示出更高的旁观者A到G转换率，尤其是在位于靶突变下游2个碱基的腺嘌呤处。另外，没有旁观者错义突变（图2a-c）。

图2

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03.NG-ABE 和 sgRNA-A6 的视网膜下递送提高了矫正率。

为了将 NG-ABE 和 sgRNA-A6 递送至小鼠 RPE，研究人员将这些表达序列包装到单个慢病毒载体 (LV-NG-ABE-A6) 中，并将慢病毒注射到3周龄rd12小鼠的视网膜下。治疗眼的Rpe65 cDNA的测序分析显示，在目标腺嘌呤（A6）处A到G的转化率高达82%，平均频率为54 ± 22%（n = 6）。检测每只没有旁观者编辑的治疗眼中精确校正的Rpe65转录本的百分比时，发现眼球中有高达40%的功能挽救等位基因，在所有眼球中平均频率为27±12%。其他修饰的转录本包括那些同时有突变和旁观者碱基(24±9%)或仅有旁观者碱基(2±1%)的A-to-G转换。识别出的十大潜在脱靶位点也被进行了测序，但没有检测到高于未治疗眼水平的脱靶编辑（图3d-h）。

图3

04.AAV2 介导的 NG-ABE/sgRNA A6 递送以较慢的速度挽救表型。

鉴于 AAV 的包装能力有限，研究人员利用拆分碱基编辑器双AAV策略。该策略可以纠正rd12小鼠RPE细胞中的突变，尽管它的作用方式比慢病毒慢，这可能与AAV血清型、两个载体的要求和细胞内反式剪接事件有关。然而，由于S-视锥的快速变性，双AAV方法不适用于测试该小鼠模型中的视网膜退化。因此，选择继续采用慢病毒方法。

05.碱基编辑在成年rd12Gnat1 -/-小鼠中恢复视锥介导的视觉功能。

将rd12小鼠与缺乏视杆转导蛋白的Gnat1 -/-小鼠 ( rd12Gnat1 -/- )杂交来消除大部分视杆介导的光反应α-亚基对下游信号转导至关重要。Gnat1的敲除对视锥结构和存活没有影响。rd12Gnat1 -/-小鼠显示出与rd12小鼠相似的视锥变性进展。在3周龄时将LV-NG-ABE-A6注射到rd12Gnat1 -/-小鼠视网膜下，并在6周龄时用明视ERG（使用两种不同波长的光）评估视锥细胞功能。使用绿光刺激记录M-视锥细胞的反应。LV-NG-ABE-A6 治疗眼的明视 ERG 波形表现出显著的 b 波，其振幅随着刺激强度的增加而增加，而未治疗眼对任何测试光强度都没有反应。类似地，当使用紫外线刺激记录S-视锥的反应时，只有治疗过的眼显示 ERG 反应，且随着强度的增加而增加（图4）。

图4

此外，视觉诱发电位(VEPs)测量了从视锥细胞到大脑视觉皮层的视觉通路的功能完整性。在对照组Gnat1−/−和处理组rd12Gnat1−/−小鼠中，闪光刺激引起的明显的VEP波形，但在未处理的rd12Gnat1−/−小鼠中不存在该种波形。然而，与对照小鼠相比，治疗小鼠中的 VEP 显示出减弱的振幅和延迟的峰值时间。另外，初级视觉皮层中单个神经元的活动在治疗后也得到了改善（图5）。

图5

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06.碱基编辑提高了成年rd12Gnat1 -/-小鼠的视锥细胞存活率。

与未治疗眼相比，视网膜平面的整体视图显示治疗眼中S-视锥显著保留。中背侧视网膜的高倍镜显示，与治疗组和对照组相比，未治疗组视网膜的M-视锥密度降低，结构异常。中腹侧视网膜的高倍镜显示治疗组有S-视锥，而未治疗组视网膜中未发现S-视锥。治疗眼的背侧（PP

图6

07.碱基编辑恢复视锥特异性光转导基因的表达并下调细胞变性相关基因。

研究人员对2个月大的WT、未治疗组和治疗组rd12小鼠进行了视网膜单细胞RNA测序 (scRNA-seq)，分析了来自三组的16 896个细胞，并将细胞分成不同的簇，这些簇通过细胞类型特异性标记基因的表达进行注释，发现三组的细胞类型分布相似。与未治疗组相比，治疗组小鼠的视锥细胞中显示出Opn1sw（S-视蛋白）的表达水平显著增加。有趣的是，与WT小鼠相比，未治疗组和治疗组rd12小鼠视网膜中Opn1mw（M-视蛋白）的表达水平更高。与治疗组小鼠相比，未治疗组rd12小鼠的视锥细胞中Arr3、Gnat2、Rbp3、Grk1和Kcne2的表达水平显著下调。相反，这些基因在治疗组视锥细胞中都显示出不同水平的表达恢复（图7）。

图7

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总结

碱基编辑迅速成为治疗遗传疾病的一种潜在方法，在不同的临床前模型中取得了可喜的成果。鉴于眼睛独特的治疗优势，以及先前在小鼠模型中成功进行基因拯救的证明，碱基编辑方法具有很大的前景。特别是针对遗传性眼病，碱基编辑是一种有效的治疗干预措施，可以用于拯救和维持遗传性视网膜变性患者的视锥细胞。另外，在患者身上进行测试之前，需要对具有中央凹的非人类灵长类动物进行额外的临床前测试。此外，应研究替代递送方法，以覆盖患者 RPE 组织在内的更广泛区域，并避免组成型碱基编辑器的表达。

参考文献：

In vivo base editing rescues cone photoreceptors in a mouse model of early-onset inherited retinal degeneration[J]. Nature Communications 2022 13(1).

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