疏水侧链氨基酸口诀（BioresourTechnol.通过重构遗传元件和细胞代谢高效生产几丁二糖脱乙酰基酶）

疏水侧链氨基酸口诀（BioresourTechnol.通过重构遗传元件和细胞代谢高效生产几丁二糖脱乙酰基酶）质粒依赖性表达系统是方便分子生物学操作和外源蛋白表达的首选。然而，在工业生产中，质粒的不稳定性不容忽视。Dac的质粒依赖表达系统也存在同样的问题。通过连续传代培养，不同批次和不同转化子的发酵培养基中Dac活性差异很大。为了克服质粒依赖性表达系统的不稳定性，作者尝试通过CRISPR/Cpf1系统将Dac合成模块整合到枯草杆菌WB600的基因组中。然而，在基因编辑的过程中，发现枯草芽孢杆菌WB600转化效率低，具有多种抗性。为了解决这个问题，作者重建了枯草杆菌底盘细胞。为了增加Dac的表达，构建了九个携带不同RBS序列的重组菌株，它们具有不同的翻译强度。RBS序列的设计是在RBS计算器的帮助下实现的（图3A）。不同翻译强度的重组菌株的Dac活性存在显著差异；在不同的重组菌株中，WB-NMK-D65-R1、WB-NMK-D65-R2、WB-NMK-D65-R3、WB-NMK-D65-R6和WB-

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今天推送的文章是江南大学生物工程学院的刘龙教授课题组于2021年8月份在Bioresource technology期刊上发表的High level production of diacetylchito- biose deacetylase by refactoringgenetic elements and cellular metabolism.

Pyrococcus horikoshii来源的几丁二糖脱乙酰基酶（Dac）可一步生产葡萄糖胺（GlcN）。Dac的高效表达和分泌在GlcN的生产中起着核心作用。本研究以枯草芽孢杆菌WB600为表达宿主，通过信号肽的筛选改造和RBS序列优化以及一些基因的编辑，最终，基因组整合菌株C6的胞外Dac活性达到6357.38 U/mL，这是迄今为止报告的最高水平。

信号肽在枯草杆菌的蛋白质表达系统中起着重要作用。如图2A所示，枯草芽孢杆菌的各种分泌途径略有不同。大多数分泌蛋白的信号肽有三种相似性质：N端富含带正电的氨基酸，并与转运体相互作用；H区富含疏水性氨基酸残基；以及具有信号肽酶切割位点的C-末端，用于去除信号肽（图2B）。从枯草杆菌中选择了12种可以在枯草杆菌中完成异源重组酶的高水平分泌的信号肽。通过pcr扩增和质粒转化获得12株重组菌株（命名为WB-NMK-D1至WB-NMK-D12）。发酵60小时后，重组菌株WB-NMK-D1、WB-NMK-D2、WB-NMK-D6和WB-NMK-D10的细胞外Dac活性高于对照菌株（图2C），所对应的信号肽分别为Mpr、BglS、NprB和AbnA。与原始信号肽YncM相比，这4种信号肽更适合引导Dac的分泌；在这些肽中，NprB是最好的信号肽。发酵60小时后，重组菌株上清液的胞外Dac活性达到3168 U/mL，这是所有重组菌株中的最高水平（图2C）。

接下来，对四株构建菌株的粗酶溶液进行SDS-PAGE分析。Dac的蛋白质分子量为32KDa。阴性对照菌株WB-NMK的发酵上清液中没有32kDa的靶蛋白，而阳性对照菌株WB-NMK-D0和其他实验菌株，包括WB-NMK-D1、WB-NMK-D2、WB-NMK-D6和WB-NMK-D10，在32kDa位置的条带清晰，虽然两条带之间没有明显的浓度差异。我们推测Dac活性的增加不足以显示表达水平的显著差异（图2D）。酶活性测定结果表明，信号肽NprB对Dac分泌的诱导作用最强。因此，接下来对重组菌株WB-NMK-D6进行修饰。

为了进一步提高信号肽NprB引导Dac分泌的能力，作者优化了其功能区，在带正电的N区和H区产生NprB突变，得到突变体N3K、T5K、N3K-T5K、N3K-L9Q和N3K-L9Q-L11D。这些突变使N端的净电荷从2增加到4，并降低H区的疏水性。图2E描述了WB-NMK-D61和WB-NMK-D62均优于原始信号肽NprB，WB-NMK-D61和WB-NMK-D62细胞外Dac活性达到3542.9 U/mL和3378.6 U/mL。信号肽N端电荷的增加显示出对蛋白质分泌的良好影响，但是，过高的N端电荷可能对蛋白质分泌有害。信号肽突变体（WB-NMK-D65）的最大细胞外Dac活性为3682.2 U/mL，比无突变的信号肽NprB高两倍（图2E）。此外，收集重组菌株和对照菌株，样品的SDS-PAGE分析如图2F所示。WB-NMK-D65发酵上清液的32 kDa目标蛋白条带较浓，这表明与对照菌株相比，WB-NMK-D65诱导更多Dac分泌到细胞外系统。

在枯草芽孢杆菌中，转录的mRNA通过RBS序列实现核糖体招募和结合，从而启动基因翻译过程。因此，RBS序列的强度直接影响核糖体的结合效率，并在一定程度上决定蛋白质的翻译强度。在线工具 (https://salislab.net/ software/），可以通过设计RBS序列预测蛋白质翻译水平并改变目标蛋白质的翻译效率。

为了增加Dac的表达，构建了九个携带不同RBS序列的重组菌株，它们具有不同的翻译强度。RBS序列的设计是在RBS计算器的帮助下实现的（图3A）。不同翻译强度的重组菌株的Dac活性存在显著差异；在不同的重组菌株中，WB-NMK-D65-R1、WB-NMK-D65-R2、WB-NMK-D65-R3、WB-NMK-D65-R6和WB-NMK-D65-R8的Dac活性在发酵60小时后显著高于对照组，其中WB-NMK-D65-R1的胞外酶活性最高，为4807.6 U/mL（图3B）。为了进一步解释酶活性的增加是由于蛋白质翻译效率的提高，我们还进行了SDS-PAGE分析。结果表明，WB-NMK-D65-R1在32 kDa位置有更明显的条带（图3C）。细胞外Dac活性和SDS-PAGE分析结果表明，优化的RBS序列确实可以提高蛋白质翻译率，从而增加蛋白质表达。

质粒依赖性表达系统是方便分子生物学操作和外源蛋白表达的首选。然而，在工业生产中，质粒的不稳定性不容忽视。Dac的质粒依赖表达系统也存在同样的问题。通过连续传代培养，不同批次和不同转化子的发酵培养基中Dac活性差异很大。为了克服质粒依赖性表达系统的不稳定性，作者尝试通过CRISPR/Cpf1系统将Dac合成模块整合到枯草杆菌WB600的基因组中。然而，在基因编辑的过程中，发现枯草芽孢杆菌WB600转化效率低，具有多种抗性。为了解决这个问题，作者重建了枯草杆菌底盘细胞。

ComK基因整合在枯草杆菌168 epr位点，用于新的重组枯草芽孢杆菌C。接下来，沉默了bpr、nprB、aprE、mpr和nprE，以获得新的重组枯草芽孢杆菌C6。所有的遗传修饰均通过CRISPR/Cpf1系统进行。该系统由两个质粒pHT-XCR6和pcrF17NM组成。质粒pHT-XCR6是木糖诱导和调控的Cas蛋白Cpf1的表达载体；质粒pcrF17 NM是一种crRNA表达载体，用于表达crRNA和插入同源修复模板。本工程CRISPR/Cpf1系统的原理如图4A所示。与枯草芽孢杆菌168相比，随着comK基因的引入，枯草芽孢杆菌C的转化效率变得更高（图4B）。六个胞外蛋白基因沉默后，重组枯草芽孢杆菌C6-D的胞外Dac活性与WB-NMK-D65-R1相似。细胞外Dac活性为4823.08 U/mL（图4C）。然而，当枯草杆菌C作为宿主时，细胞外Dac活性显著降低。这些结果与Krishnappa等人的结论一致，表明枯草芽孢杆菌中存在细胞外蛋白酶可以降解分泌到细胞外细胞中的目标蛋白。

为了稳定表达Dac基因，将Dac合成模块整合到枯草芽孢杆菌C6的基因组中（图5A）。选择枯草芽孢杆菌的lytC基因作为目标整合位点。此外还选择了其他靶点整合位点，如sigD-RNA聚合酶sigma-28因子和comA双组分反应群体感应调节因子。CRISPR/Cpf1系统不仅可以实现Dac合成模块的集成，还可以同时删除非必需基因。此外，还研究了不同拷贝数对Dac表达的影响。如图5B所示，随着基因组拷贝数的增加，胞外酶活性增加。与枯草芽孢杆菌C6-D相比，具有3个完整拷贝的枯草芽孢杆菌C6CDA显示出更高的胞外Dac活性，为6357 U/mL。有趣的是，整合基因组的枯草芽孢杆菌C6CDA菌株分泌Dac的时间从60 h缩短到48 h。然而，其机制尚不清楚。

为了进一步证明多拷贝数的整合表达优于质粒的自由表达，通过RT-qPCR验证了Dac基因的过表达（图5C）。结果表明，含有3个完整拷贝的重组枯草芽孢杆菌C6CDA的转录强度高于无质粒表达。SDS-PAGE分析表明，与枯草杆菌C6-D相比，枯草杆菌C6CDA在32 kDa位置具有更明显的条带（图5D）。

与对照菌株B.subtilis 168和B.subtilis C6相比，B.subtilis C6CDA的细胞生长和葡萄糖消耗略低（图6A和图6B）。然而，随着细胞的生长，枯草芽孢杆菌C6CDA的生长最终超过了对照菌株。这一观察结果可能与去除编码基因的溶菌酶有关，如LytC，它在噬菌体感染、细胞分裂和分化中起着重要作用。如图6C所示，与对照菌株相比，枯草芽孢杆菌C6CDA显示出较低的细胞自溶率。因此，证明LytC基因的缺失可能是细胞生长加速的原因之一。

总之，通过表达元件的优化，本研究提高了枯草杆菌WB600中的细胞外Dac活性。然后，利用CRISPR/Cpf1系统构建了一种具有高转化效率的新型底盘细胞。接下来，作者进行了Dac的无质粒表达，发酵后细胞外Dac活性达到6357.38 U/mL。本研究开发的枯草杆菌C6CDA在Dac的工业生产中显示出巨大的潜力。此外，底盘细胞中的负调控因子消除和整合的靶蛋白表达的结合可以为微生物细胞工厂中异源蛋白的合成和表达提供策略。

整理:闫亚茹

文章信息:

PMID: 34469820

DOI: 10.1016/j.biortech.2021.125836

文章链接: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34469820