细胞培养正确方法（细胞培养常见问题分析）
细胞培养正确方法（细胞培养常见问题分析）1、细胞死亡的可能原因：细胞培养常见问题分析：HF180二氧化碳培养箱奥利巴斯倒置显微镜 Neofuge15离心机
将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH 是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2 浓度也要定时检查。
细胞培养一般所需要主要仪器设备如下：
AlphaClean1300洁净台
HF180二氧化碳培养箱
奥利巴斯倒置显微镜
Neofuge15离心机
细胞培养常见问题分析：
1、细胞死亡的可能原因：
A：如果是污染，最可能的是支原体，一般在培养两周左右细胞基本全部死亡；
B：血清浓度：大于15%培养液即偏黄；
C：CO·是否不足；
D：细胞传代次数过多，细胞老化；
2、PH变化快的原因：
A：二氧化碳张力不对；
B：培养瓶塞拧得太紧；
C：缓冲体系缓冲力不足；
D：培养液中盐浓度不正确；
E：.细菌、酵母、真菌等污染
3、冷冻管应如何解冻：
取出冷冻管后， 须立即放入37 ℃水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。
另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂
4、细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO：
除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
5、可否使用与原先培养条件不同之培养基？
不能，每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活
6、培养基中是否须添加抗生素？
除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素。
7、欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？
回收动物细胞， 其离心力约为300xg (约1000RPM)，5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡.
8、应如何避免细胞污染？
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法，选择的CO2培养箱最好具有高温消毒功能，一旦出现污染马上可以进行彻底消毒，市面上有90℃高温湿热灭菌型，如HF90培养箱，还有另外一种高端型180℃高温干热灭菌培养箱，如HF180 二氧化碳培养箱。
9、可否使用与原先培养条件不同之血清种类？
不能，血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源， 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
10、培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？
一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5 % CO2 培养细胞，推荐使用HealForce HF90二氧化碳培养箱或其他知名品牌的CO2培养箱，HF90二氧化碳培养箱具有高温灭菌功能，同时具有Auto-start的CO2传感器自动校准功能，能够提供稳定的CO2控制，均一性好，有利于细胞的培养。
HF90培养箱
11、冷冻保存细胞之方法：
冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃，30~60min→ (-20 ℃，30 min) → （-80 ℃，16~18 h(或隔夜) ） → 液氮槽长期储存。
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽长期储存（-20 ℃不可超过1 H）， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
推荐使用HealForce HFLTP 低温冰箱产品或其他一线品牌产品，HFLTP低温冰箱包括-86℃超低温冰箱，-40/-25℃低温冰箱，2-8℃冷藏箱，满足不同实验所需，产品具有温度稳定、占地面积小、降温速度快等特点。
HFLTP 86超低温冰箱
HFLTP 25低温冰箱
HFLPT 05冷藏箱
12、保存血清最好的方法?
建议血清应保存在-5℃至-20℃（推荐HFLTP 25（260）低温冰箱）。然而，若存放于4℃时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。
13、如何解冻血清才不会使产品质量受损?
建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解（推荐HFLTP 05（310）冷藏箱），然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。
14、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理：
血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400*g稍微离心 上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。
15、为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀：
胎牛血清没有预老化，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在－20℃储存胎牛血清（推荐HFLTP 25（260）低温冰箱），避免反复冻融。
参考文献：《组织培养和分子细胞学技术》北京出版社
