pcr的市场分析（数字PCR技术以及市场主要竞品分析）
pcr的市场分析（数字PCR技术以及市场主要竞品分析）dPCR在病原微生物检测、microRNA研究、基因表达研究、NGS测序文库的绝对定量、表观遗传学直接相关的DNA甲基化定量检测、chip定量鉴定等领域的应用都令人极为期待，而在转基因成分鉴定、分子标准品精确定量、环境样本检测等具体的应用方向上，已经有大量实验数据和结果证明了dPCR技术的优良性能。【广泛的临床以及科研应用领域】【PCR的技术特点】数字PCR的技术特点能够绝对定量：常规PCR定量需要制定已知拷贝数的标准DNA曲线，但是由于待检样本与标准曲线不在统一体系，条件上会存在差异，另外加上PCR扩增效率的差异从而影响定量结果的准确性。而数字PCR不受标准曲线和扩增动力学影响，可进行绝对定量。1）、样本需求量低：适用于珍贵样本或核酸降解严重的样本。2）、灵敏度高：数字PCR是将传统PCR反应体系分割成数万个独立PCR反应，这些反应可以精确地检测很小的目的片段差异、单拷贝甚至低浓度的混杂
【PCR的工作原理】
图1 数字PCR的工作原理
将 30μL 含有样品的PCR预混液制备成至少 50000 个微滴 ，把核酸分子包裹在微滴中独立进行 PCR扩增；PCR扩增后 ，对每个样品中的微滴逐个检测 ，有荧光信号的微滴为阳性微滴，反之为阴性液滴。根据记录到的阳性液滴 / 总微滴数计算出靶分子的拷贝数。数字PCR采用直接计数的方法进行定量分析，即在PCR扩增结束后有荧光信号的反应单元记为1，无荧光信号记为0，有荧光信号的单元说明至少含有一个拷贝的目标分子。如果目标DNA浓度极低的情况下，理论上可以认为有荧光的单元数目就等于DNA分子的拷贝数，但通常情况下，数字PCR的反应单元中可能会包含两个甚至以上的目标分子，因此需要采用泊松概率分布公式来进行计算：
图2 dPCR的数据分析原理 —— 泊松分布
【PCR的技术特点】
数字PCR的技术特点能够绝对定量：常规PCR定量需要制定已知拷贝数的标准DNA曲线，但是由于待检样本与标准曲线不在统一体系，条件上会存在差异，另外加上PCR扩增效率的差异从而影响定量结果的准确性。而数字PCR不受标准曲线和扩增动力学影响，可进行绝对定量。1）、样本需求量低：适用于珍贵样本或核酸降解严重的样本。2）、灵敏度高：数字PCR是将传统PCR反应体系分割成数万个独立PCR反应，这些反应可以精确地检测很小的目的片段差异、单拷贝甚至低浓度的混杂样本。且能避免非同源异质双链的形成。3）、高耐受性：由于目的序列被分配到多个独立反应体系中，显著降低了背景信号和抑制物对反应的干扰，扩增基质效应大大减小。
图3 dPCR的主要优势
【广泛的临床以及科研应用领域】
dPCR在病原微生物检测、microRNA研究、基因表达研究、NGS测序文库的绝对定量、表观遗传学直接相关的DNA甲基化定量检测、chip定量鉴定等领域的应用都令人极为期待，而在转基因成分鉴定、分子标准品精确定量、环境样本检测等具体的应用方向上，已经有大量实验数据和结果证明了dPCR技术的优良性能。
图4 dPCR的主要临床应用
【数字PCR仪器市场中主要的竞品分析】
市面上常见的dPCR主要有两种：微滴式dPCR（droplet dPCR，ddPCR）和芯片式dPCR（chip dPCR，cdPCR）技术。由于芯片式dPCR制造芯片的成本较高，目前微滴式dPCR正越来越受到企业的认可。微滴式dPCR全球主要玩家介绍， 包括有伯乐的QX-200，法国的Stilla Naica，凯杰的QIAcuity，Life 3D，国内的小海龟，达微生物等。（本期主要介绍上述这几家公司，另外还有包括广州的永诺、苏州锐迅、思纳福等重要公司将在下期进行讲解，如果各位还有想关注的数字PCR这个领域的其他玩家的也欢迎在后台进行留言）。
伯乐的QX200系统：QX200可以将体系分割成2万个微滴，Rain Drop可以分割成100万-1000万个微滴。ddPCR原理是通过将一个待分析的PCR反应体系进行微滴化处理，利用微滴发生器制成近20000个油包水小微滴从而对原始体系进行分割，样品中的核酸分子随机分配到大量独立的微滴中，每个微滴中含有一个或不含待检核酸分子。对微滴体系进行扩增反应以后，分析每个微滴的荧光信号，进行有或无的判断，将判断结果按照泊松分布的原理，通过读取靶标和内参核酸的阳性微滴个数以及比例从而得到靶分子的拷贝数及浓度。与芯片式dPCR相比，操作简单，可以实现高通量的检测，也保证一定程度上的微滴检测稳定性。
图 5 伯乐QX-200产品介绍
法国的Stila Naica公司的Sapphire芯片：Naica crystal全自动微滴芯片数字PCR系统是法国Stilla公司开发的下一代核酸绝对定量技术。使用cutting-edge微流体创新型芯片——Sapphire芯片作为数字PCR过程的唯一耗材。样品通过毛细通道网格以30 000个微滴的形式进入2D芯片中，可称作Crystal微滴。PCR扩增实验在芯片上实现。对微滴成像用以检测包含扩增片段的微滴。最后一步是对阳性微滴计数从而得到精准的核酸绝对数量。Crystal微滴数字PCR，结合了强大的图像分析技术和直观可视的检测功能，从而达到了数字PCR定量卓越的置信水平，获得的数据真实可信。
图 6 Stila Naica公司的Sapphire芯片系统
两种芯片版本：4样本 /片版的生成液滴数为 3万；16 样本 /片版的生成液滴数为 7 千；液滴是依靠阶梯乳化的方法来生成的，生成之后在芯片内平铺成阵列，在芯片内直接进行PCR反应，生成和扩增在制备仪中进行，缺点是扩增容易受到芯片内的气泡影响。产品的主要特点是依靠荧光成像的方式进行液滴检测，数据质控环节有优势，3荧光通道（其中1个为阴性液滴通道专用）。
图7 sapphire chip的介绍
凯杰公司的QIAcuity：QIAcuity数字PCR系统，其设计理念上充分考虑了科学家的研究需求，独具匠心的一体式集成纳米芯片的设计真正做到了化繁为简。据悉，本次上市的四台不同型号的QIAcuity数字PCR系统拥有目前最高的5色荧光检测通道及1通道的参比荧光通道，可有效监测纳米芯片小孔中的上样情况，获得更精准的结果。不仅如此，QIAcuity Eight更可容纳8块芯片上样的通量，内部加载的双热循环模块实现了8小时高达1 248样本的处理通量。创新性纳米芯片采用微流体技术，在芯片中加入反应混合液后放入QIAcuity系统中，仪器自动将样品压入微流体芯片的纳米小孔中并对每个小孔独立密封。芯片技术保证分配到每个纳米小孔中液滴大小均一，绝无液滴交叉污染。
QIAcuity系统的操作如同qPCR实验一般简便，样品制备包括将PCR预混液、探针、引物混合物转移到纳米芯片上。该系统将分区、热循环和成像功能集成到一个全自动仪器中，从样本到结果在2小时内即可呈现。数据结果可以在Software Suite上进行分析，不仅可提供目标序列的copy/uL浓度，还可提供质控数据，包括如阳性样品或NTC。该分析还可以扩展到同一局域网（LAN）内的远程计算机。
图8 凯杰的微流体纳米芯片
图9 微流体纳米芯片功能介绍以及工作流程
Life 3D的数字PCR产品：QuantStudio 3D 数字 PCR 芯片采用使工作流程变得简单方便。不像其它的方法需要多次转移步骤和前期样品消化，QuantStudio 3D 数字 PCR 芯片仅需简单加样并封膜——即可进行 PCR 分析。能同时完成 24 块芯片的热循环步骤，而且每个芯片的读取时间少于 30 秒，QuantStudio 3D 数字 PCR 系统使用简单、简化的工作流程完成数字 PCR。
图10 QuantStudio 3D 数字 PCR 芯片
小海龟的数字PCR芯片介绍：小海龟的BioDigital•華是新一代芯片式数字PCR，是国内首款规模量产的全自主技术数字PCR产品，打破国外公司的绝对垄断，通过dPCR芯片（微流控芯片）将一个PCR反应中待检测的核酸分子分散到2万多个微液滴中，采用终点直接计数的方式对各个核酸分子分别计数，检测结果与PCR扩增效率无关，无需使用标准曲线即可实现核酸的绝对定量。每个液滴都是一个封闭独立的微反应室，避免了PCR抑制剂及不同核酸分子扩增产物间的相互干扰，大大提高了结果的准确度和实验的可重复性。
图10 小海龟的数字PCR仪器以及芯片介绍
达微的数字PCR芯片：微生物OsciDrop™数字PCR仪采用该公司独创并具有自主知识产权的DAPCO™技术（Droplet Array Production by Cross-interface Oscillation，界面振动微滴阵列），具有全自动、高通量、低成本三大突出优势，可实现“样本进、结果出”的全自动流程，在3小时内可分析高达96样品，在仪器和试剂耗材上兼具成本优势。不同于主流进口数字PCR仪微流控芯片的液滴制备方式，达微生物DAPCO™技术将数字PCR流程中的手工移液、微滴生成、PCR扩增和荧光检测等环节集成，简化实验操作、缩短实验时间，开创了数字PCR“样本进、结果出”的全新使用模式。在通量上，OsciDrop™数字PCR仪可以在3小时内完成高达96个样本的并行自动检测（包含PCR扩增的时间）。检测通道方面，采用四个荧光通道（FAM、HEX、ROX、Cy5）的成像系统，增加了可同时检测的核酸靶点。此外，OsciDrop™数字PCR仪在检测过程中不需要进行微滴转移，避免了伴随微滴转移而经常发生的有效微滴损失、微滴融合和核酸污染，有效微滴率>95%，显著高于国际主流数字PCR仪。值得一提的是，由于DAPCO™技术的独特优势，大幅降低了数字PCR的试剂耗材的成本。
图11 基于微管道的振动液滴制备技术
图12 OsciDrop全自动一体式数字PCR仪的主要介绍
