广州分子生物学pcr检测技术方案（分子技术HRM检测技术介绍）

广州分子生物学pcr检测技术方案（分子技术HRM检测技术介绍）灵活性：Pyrosequencing等通量高：NGS等时间快速：ARMS-PCR，HRM等成本低：PCR，PCR-RFLP，MassARRAY等准确：Sanger等

来源：基因talks

前 言

基因的变异类型有多种（点击查看），对应的分子检测方法亦有多种，当前资本市场驱动着分子检测市场，并极力追捧NGS技术，因为其通量高，灵敏度高且性价比高。小编承认NGS是分子检测的必然发展趋势，但是短时间内，NGS并不会取代其他分子检测方法，因为针对不同的需求，都有对应的理想检测方法，每个检测平台都有着自己的优势，比如：

操作简单：PCR，ARMS-PCR，HRM等

时间快速：ARMS-PCR，HRM等

成本低：PCR，PCR-RFLP，MassARRAY等

准确：Sanger等

通量高：NGS等

灵活性：Pyrosequencing等

结果分析简单：ARMS-PCR等

自动化：核酸提取等

......

小编一直认为：没有最好的技术，只有最合适的技术！最好的，不一定是最合适的；最合适的，才是真正最好的。

今天，我们聊一聊HRM技术，首先，我们先了解下什么是HRM？

HRM：高分辨率熔解曲线（High-resolution melting curve HRM）。PCR扩增的融解曲线取决于其扩增序列，序列中一个碱基的突变都可以导致双链DNA的解链温度发生变化，通过使用实时荧光定量PCR仪监测这种细微的温度变化（但是这个差异极小，只有零点几摄氏度，如果仪器的分辨率不高，是根本无法检测的），可以知道扩增的序列中是否有突变发生，从而对其进行基因分型。

HRM实施的基础是不同核酸分子物理性质的差异，通过实时跟踪、收集升温过程中饱和荧光染料与PCR产物结合的信息，并进行软件分析形成溶解曲线。温度低时，染料结合牢固，荧光信号强；升高温度，DNA双链解开，荧光染料随之解离，荧光强度减弱。当温度达到Tm值，50%的双链DNA解成单链，荧光信号强度达到最低。

HRM检测原理

常规实时PCR使用的是不饱和SYBR Green染料，由于这种染料对PCR有抑制作用，所以使用浓度必须远低于使DNA双螺旋结构中小沟饱和的浓度。该技术难以保证染料与所有PCR产物结合，影响了检测的分辨率（不饱和染料在dsDNA解链时，荧光分子重新结合于未解链的dsDNA部位，荧光信号没有变化，不能反应样品熔解温度）。目前HRM使用的是一类与DNA结合能力更强和对PCR抑制作用更小的饱和染料（因为它们即便在饱和浓度（荧光最大）下，也不会抑制PCR），如Eva Green、LC Green、SYTO9等（饱和染料在dsDNA解链时，荧光分子同步脱落，信号减弱）。因为饱和染料的使用，大大提高了HRM在单碱基突变、小片段插入/缺失方面检测的灵敏度和分辨率。

HRM技术对实验仪器的温度分辨率要求相当高，需要达到0.02~0.1℃，每升高1℃采集荧光25次，以满足对单碱基差异的区分。HRM对温度均一性同样要求较高，Tm的标准偏差为0.020-0.264℃（孔间温度均一性要达到0.264℃以内才能保证HRM分析结果的准确性），一般PCR两孔间温差在0.3~0.5℃，这就导致两孔间最终溶解温度相差较大，无法保证HRM分析结果的准确性。（做HRM的话一般Roche的LightCycler 480可以考虑，公用热室，可以保证单次PCR各反应管间温度的均一性，而且有特殊的模块加热技术及快速散热装置）

基因型一般有三种，野生纯合，杂合，突变纯合。首先变性，双链解开，接着退火（假设60℃），此时引物结合模板，然后在Taq DNA聚合酶的作用下继续延伸（假设72℃），此时所有的饱和荧光染料嵌和在双链中，荧光信号很强，接着再变性，此时的HRM监测的是72℃-95℃之间的温度变化（直观的就是荧光染料的信号强度变化）。HRM得以区分单碱基差异是建立在DNA碱基本身的特性上的。G/C碱基对由三个氢键连接，A/T碱基对由两个氢键连接，打断三个氢键较打断两个氢键需要更高的能量，体现在G/C碱基对具有更高的Tm值，也就是说多态性位点为G/C的双链其熔解的发生较多态性位点为A/T双链更晚（见下图1）。比如上图现在是T>C，那么野生纯合是蓝色线，突变纯合是红色线，杂合是红蓝混合色（灰色），由于CC和TT是同源双链，那么CC跟TT型根据Tm很好区分，由于CT中会出现异缘双链，这就会出现四种配对方式：AT，CG，GT，AC（见下图2），其中AT，CG的混合使杂合型的熔解曲线表现为前两种熔解曲线的整合形，而GT，AC的错配双链使它的熔解曲线更趋向低温区，综合以上使杂合型的熔解曲线与纯合型的熔解曲线呈现交叉。（注：也可参考上篇ARMS方法设计引物，使用两种不同的等位基因特异性正向引物，正向引物3'端的最后一个碱基对应于SNP位点的二等位基因，反向引物都一样，并使用荧光染料来检测PCR产物。纯合子基因组DNA只能被与其完全匹配的正向引物扩增，而杂合子基因组DNA能同时和两种正向引物结合扩增出两种PCR产物，这就可以很直观的理解出四种配对的方式了）

图1. G/C碱基对比A/T碱基对具有更高的Tm值

图2. 杂合子溶解曲线由四种配对方式混合而成

结果解读：允许在熔解相的前后进行充分的数据收集。在围绕所观察到的Tm值上下超过10°C（甚至更大）的温度窗口内捕捉HRM数据值。这为有效进行曲线的标准化提供了足够的基线数据值，可促进形成更为紧密的复性数据并且能够更轻松地进行数据解释。

HRM本质

HRM的数据分析是通过比较不同样本之间熔解曲线的位置和形状上的差异，来对基因型进行区分的。标准的HRM软件包能够将样本熔解曲线的形状和位置与对照进行比较。这一方法可能导致产生难以解释的不可靠结果，因此有时可能必须要进行耗时的人工数据解释。

当然，并不是每种SNP用HRM都好区分的，根据碱基变异的类型，SNP可化分为四个等级，其中第IV类SNP即A/T变异，由于其Tm变化非常小（＜0.2℃），被公认为是最难检测的SNP类型，此时可以看看市场上的商品化试剂盒，比如Qiagen的，好像有一款是可以做到A/T的。

SNP可化分为四个等级

HRM法应用实例介绍

实例1：比如现在有一例人工心脏瓣膜移植患者，手术后需要使用华法林抗凝，我们需要对CYP2C9的相关基因型进行检测（点击查看），来进行起始用药剂量的预测。

HRM法检测CYP2C9基因型

实例2：一名肺腺癌患者，考虑是否使用吉非替尼，对EGFR突变进行检测。由下图可以看出HRM法检出了EGFR的19del和L858R突变，HRM法不仅10%的突变可以检测出来，1%甚至0.1%的突变也都可以检测出来，虽然HRM的灵敏度很高，但是轻微的污染也可导致假阳性的产生，故HRM技术方法并没有那么普及的应用于临床，目前还是科研的居多。

HRM法检测EGFR基因突变

整个实验主要操作步骤

HRM检测技术点评

优点：

1，操作简单，不需要探针；

2，时间快速；

3，灵敏度高，可检测低至1%的突变；

4，只有一次开盖过程，有效防止污染；

5，整个操作只需Real-time PCR仪；

6，可以发现未知突变；

7，成本很低。

缺点：

1，未知突变的，不知道具体突变类型；

2，对操作人员的要求较高（轻微污染可致假阳性）；

3，对Real-time PCR仪的要求较高。

此方法适宜于有相关仪器的实验室进行突变检测和筛选，特别是体细胞突变。