大肠杆菌表达真核生物基因的缺陷（外源基因在大肠杆菌中的诱导表达）
大肠杆菌表达真核生物基因的缺陷（外源基因在大肠杆菌中的诱导表达）2．实验试剂含外源基因质粒pET28a-V的表达菌株BL21（DE3）或其他含外源基因的表达载体的宿主菌。将外源基因克隆在含有Lac启动子的表达载体中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，LacⅠ产生的阻遏蛋白与Lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录及表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入Lac操纵子的诱导物IPTG，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。表达蛋白可做SDS-PAGE检测（参照实验33）或Western杂交鉴定（参照实验21）。【实验材料、试剂与仪器】1．实验材料
【实验目的】
（1）了解外源基因在原核细胞中表达的特点。
（2）掌握异丙基硫代-β-D-半乳糖（IPTG）诱导外源基因表达的过程与操作步骤。
【实验原理】
将外源基因克隆在含有Lac启动子的表达载体中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，LacⅠ产生的阻遏蛋白与Lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录及表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入Lac操纵子的诱导物IPTG，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。表达蛋白可做SDS-PAGE检测（参照实验33）或Western杂交鉴定（参照实验21）。
【实验材料、试剂与仪器】
1．实验材料
含外源基因质粒pET28a-V的表达菌株BL21（DE3）或其他含外源基因的表达载体的宿主菌。
2．实验试剂
（1）LB液体培养基：10g细菌培养用胰蛋白胨（tryptone），5g细菌培养用酵母抽提物（yeast extract），10g NaCl，溶于800mL水中，加热溶解后，用10mol/L NaOH调节pH值至7.0，121℃高压灭菌20min，备用。
（2）50mg/mL氨苄青霉素溶液：1g氨苄青霉素溶于200mL水中，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装至小管中，－20℃贮存。
（3卡那霉素（Kan）溶液：用无菌水配制成50mg/mL溶液，－20℃保存。
（4）IPTG溶液：在8mL蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定溶至10mL，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1mL每份，－20℃保存。
3．实验仪器
高速离心机（每4人1台）
恒温摇床（全班1台）
－20℃冰箱（全班1台）
恒温水浴锅（每4人1台）
高压灭菌锅（全班1台）
电子天平（每8人1台）
各种规格吸头（若干）
微量移液器（每2人1套）
1．5mL离心管（若干）
超净工作台（每8人1台）
超净工作台上的相关器皿：平底锥形瓶
（100mL）、培养皿、接种针等
SDS-PAGE装置（每4人1套）
【实验步骤】
（1）对照菌和含有重组表达质粒的宿主菌株挑取单菌落（由实验29获得），划单克隆平板，37℃培养12～16h。
（2）挑取单克隆接种入5mL含一定量的相应抗生素（50μg/mL）的LB液体培养基中，37℃、230r/min培养12～16h。
（3）取50μL培养液接种入含一定量的相应抗生素的LB液体培养基中37℃培养2h以上，至菌生长至对数中期（OD550＝0.3～0.5）。
（4）吸出1mL未经诱导的培养物放在1个微量离心管中，按下面步骤（6）所述进行处理。
（5）在剩余培养物中加入IPTG至终浓度1mmol/L，37℃继续培养。
（6）在诱导的不同时间（如1、2、4和6h）取1mL样品放于微量离心管中，测定OD550，4℃、高速离心1min，收集菌体－20℃保存备用。
（7）进行SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳检测（参照实验3、32）。
【典型实验结果分析】
理想实验结果（见图14.1）
含有外源基因的重组质粒的菌株经IPTG诱导后表达出目的蛋白片段，而不含重组质粒的菌株则不表达该蛋白条带。
图14.1 大肠杆菌外源基因表达蛋白的SDS-PAGE结果
1：诱导前；2～6：诱导0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h的表达蛋白；M：蛋白质分子大小标准参照物
【注意事项】
（1）实验前必须查阅有关书籍和资料，写出可行的实验步骤，了解有关数据、试剂、灭菌等的细则后方可开始实验。
（2）IPTG的浓度对表达水平影响非常大。实验中，应在0.01～5.0mmol/L范围内改变IPTG浓度，寻找最佳浓度。
（3）生长温度是影响在大肠杆菌获得高水平表达的最重要因素，通过实验确定最佳温度是表达外源蛋白的关键。
（4）外源基因不能带有间隔序列（内含子），因而必须用cDNA或化学合成的基因，不能用基因组DNA。
【实验讨论】
问题1：大肠杆菌表达载体的结构有何特点？
答：复制子、筛选标志、启动子、终止子和核糖体结合位点是构成表达载体的基本元件。理想的大肠杆菌表达载体需要具有以下特征：①具有稳定的遗传和复制能力；②具有筛选标记，用于重组体的筛选；③基因转录可调控，受抑制时本底转录水平较低；④具有多克隆酶切位点，便于外源基因的插入；⑤转录能在适当位置终止，转录过程不能影响表达载体的复制。
问题2：外源基因在大肠杆菌中高效表达易形成包涵体。包涵体的形成有利于表达产物的纯化，但产生大量不具有生物活性的产物。如何减少包涵体的形成？
答：解决方案有：（1）采用胰胨—磷酸盐培养基能够限制包涵体的形成。（2）培养液中加入甜菜碱和山梨醇来改变渗透压，使表达产物由包涵体形式转变为活性状态，将温度从37℃降低到25℃时诱导表达，可降低包涵体的形成。（3）选用pMBI衍生而来的载体质粒。因为其可以协同表达DnaK-DnaJ或GroEL-GroES，增加凝结蛋白的溶解度。分子伴侣折叠作用效率与细胞DnaK-DnaJ和GroEL-GroES的浓度有关。
