如何用标准曲线精准定量（定量方法知多少--绝对定量）

如何用标准曲线精准定量（定量方法知多少--绝对定量）缺点：无法进行qRT-PCR 的逆转录步骤，大大影响了反应效率。优点：易于生成、定量，可在适当的储存条件下维持稳定性。如何选择标准品？如前所述，生成绝对标准曲线采用的模板将决定数据的准确度。所以最好使用与实验样本尽可能类似的目标模板，可优选有证的标准物质或参考物质。那么制备标准品的常见方法如下：☑ DNA 标准品：目的靶点的PCR扩增片段或含有目的靶点的质粒克隆（图2）。

在做qPCR实验时，我们经常会问：“你是做绝对定量还是相对定量呢？”，而定量方法的选择是取决于实验的目标。绝对定量可测定目标核酸分子的实际拷贝数，但也是最费力、最复杂的定量形式。此方法要求周密的实验方案和高度准确的标准曲线，常用于确定病毒滴度。

使用标准曲线进行绝对定量

绝对定量是通过样品的Cq值和标准曲线进行比较实现的。首先为了建立标准曲线，需要已知拷贝数浓度的标准品，对标准品进行5次以上的连续梯度稀释，将稀释的标准品进行实时荧光定量PCR扩增，最后根据各样品的拷贝数浓度及相应的Cq值绘制标准曲线，得到线性方程Cq= -klgX0 b，其中X0为起始模板量。然后将未知样本的Cq值与此标准曲线进行比较，确定其拷贝数浓度。

从图1可以发现，当模板起始浓度越大时，荧光达到阈值的循环数越少，即Cq值越小。反之，模板起始浓度越小时，Cq值越大。起始模板量的Log值与循环数Cq值呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，即可确定未知待测样本中目的基因的量。

如何选择标准品？

如前所述，生成绝对标准曲线采用的模板将决定数据的准确度。所以最好使用与实验样本尽可能类似的目标模板，可优选有证的标准物质或参考物质。那么制备标准品的常见方法如下：

☑ DNA 标准品：目的靶点的PCR扩增片段或含有目的靶点的质粒克隆（图2）。

优点：易于生成、定量，可在适当的储存条件下维持稳定性。

缺点：无法进行qRT-PCR 的逆转录步骤，大大影响了反应效率。

PCR扩增片段：通过常规PCR进行目的片段扩增，回收纯化PCR扩增片段，可直接作为标准品，相对于质粒，PCR扩增片段不是那么稳定。

质粒克隆：将目的片段进行PCR扩增，回收目的条带后连入T载体，再进行质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用。

☑ RNA 标准品：目的靶点的体外转录RNA(图3)

优点：结合了RT效率，最大程度地模拟了目的靶点。

缺点：需要耗费时间生成该标准品，因其不稳定，难以保持长期准确度。

体外转录RNA：利用实时荧光定量PCR生成的PCR 产物可利用包含5’ T7启动子的序列和包含 3’ poly(T) 的逆转录引物重新扩增。体外转录反应生成多聚腺苷酸化正义mRNA。纯化后可将其准确定量并稀释，用于生成标准曲线。

Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统——绝对定量示例

1、实验方法：

•方法:从组织中提取基因组DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测

•试剂:PerfeCTa qPCR ToughMix UNG(QuantaBio)

•标准品:质粒标准品浓度为10^6、10^5 、10^4 、 10^3 、10^2、10^1；3个重复；设阴性空白对照

•实验步骤:提取gDNA→设计特异引物探针→qPCR扩增→结果分析

2、实验数据：

3、标准曲线：

R^2=1 y= -3.349x 32.87

关于Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统

来自美国Azure Biosystems公司，以创新服务于生命科学为愿景。Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统融合了高品质Peltier温度模块和基于光纤传输的光学检测系统，为您的科学研究提供高精准、高灵敏的可靠结果。Azure Cielo-3/6检测通道，可根据实验需求灵活配置。同时配有10.3触控系统，主机本身可独立运行、连接、远程交互，让您随时随地知悉实验进程和及时获得实验结果。