目的基因的检测和筛选方法（脂质纳米颗粒与siRNA共递送以增强和延长基因表达）

目的基因的检测和筛选方法（脂质纳米颗粒与siRNA共递送以增强和延长基因表达）图3 集群模式筛选中 LNP 介导的局部肝内 pDNA 递送为了选择具有强肝脏特异性转基因表达的LNP制剂，作者使用萤火虫荧光素酶pDNA评估了整个文库的递送效率，并测量了HepG2细胞中的荧光素酶蛋白表达（图2a）。在辅助脂质不变时，调整LNP配方中的上述四个参数会显着改变基因表达水平。在1080个LNP制剂中，每个辅助脂质组的32个表现最好的LNP如图2b所示。流式细胞结果 (图2c-e) 证实了这些LNP的高体外转染效率和良好的生物相容性。DLS结果 (图2f-g) 表明大多数 LNP 的尺寸小于 400 nm (~73.9%)，并且由阳离子辅助脂质制备的LNP粒径较小(<400 nm)的比例比其由其他辅助磷脂制备的LNP高。文章内容作者选用了DLin-MC3-DMA，DMG-PEG2000，胆固醇和六种辅助磷脂（DOTAP，DDAB，DOPE，DSPC，18PG和14PA）之

背景介绍

递送系统和方法的开发仍然是基因治疗的重要挑战。基于 RNA 和 DNA 的生物制剂具有调节细胞活动以治疗遗传和获得性疾病的广泛能力。在非病毒基因传递载体中，LNPs 的临床成功最近引起了广泛关注 (例如，ONPATTRO®和mRNA COVID-19疫苗)。正在进行临床研究或市场上的大多数基于脂质的核酸递送平台由四种或五种成分组成：可离子化脂质、胆固醇、聚乙二醇化脂质和辅助磷脂，以及选择性器官靶向脂质。尽管这些制剂已经验证了封装mRNA或siRNA并介导细胞摄取和内体逃逸的能力，但缺乏辅助脂质和LNP组分对质粒DNA (pDNA) 递送转染效率影响的深入分析。

约翰霍普金斯大学的Yining Zhu等人在这篇Nature Communications的研究论文中报告了一个多步骤筛选平台 (图1)，以系统地测试和分析具有不同辅助脂质和成分比例的1080种LNP制剂在体外和体内的肝脏靶向转染效率。为了充分实现LNP介导的pDNA递送的潜力，需克服的另一个挑战是免疫介导的转基因沉默。作者描述了一种新的siRNA共递送策略，该策略针对调节炎症反应途径的关键转录因子，以减少炎症诱导的基因沉默。

图1 用于肝脏靶向pDNA递送的脂质纳米颗粒 (LNP) 的多步组成筛选示意图

文章内容

作者选用了DLin-MC3-DMA，DMG-PEG2000，胆固醇和六种辅助磷脂（DOTAP，DDAB，DOPE，DSPC，18PG和14PA）之一，通过改变以下四个参数设计了1080个LNP的文库：(1) DLin-MC3-DMA与辅助脂质范围的比率从1到200；(2) 胆固醇与DMG-PEG2000的比值在10到500之间；(3)DLin-MC3-DMA和辅助脂质的组合百分比范围为20%至80%；(4) N/P比率在4到12之间。

图2 体外LNP介导的pDNA递送

为了选择具有强肝脏特异性转基因表达的LNP制剂，作者使用萤火虫荧光素酶pDNA评估了整个文库的递送效率，并测量了HepG2细胞中的荧光素酶蛋白表达（图2a）。在辅助脂质不变时，调整LNP配方中的上述四个参数会显着改变基因表达水平。在1080个LNP制剂中，每个辅助脂质组的32个表现最好的LNP如图2b所示。流式细胞结果 (图2c-e) 证实了这些LNP的高体外转染效率和良好的生物相容性。DLS结果 (图2f-g) 表明大多数 LNP 的尺寸小于 400 nm (~73.9%)，并且由阳离子辅助脂质制备的LNP粒径较小(<400 nm)的比例比其由其他辅助磷脂制备的LNP高。

图3 集群模式筛选中 LNP 介导的局部肝内 pDNA 递送

为了评估它们的局部体内组织转染效率，通过肝内注射测试显示出最高范围的体外转染效率的LNP (图3a)。作者首先根据体外转染效率（图2c-e）将每个辅助脂质性能最佳的LNP制剂分组为四个簇（总共24个簇和每个簇8个制剂）。通过肝内注射以每只小鼠3 μg pDNA的总剂量递送萤光素酶 (Luc) (50%)和mCherry (50%) pDNA的组合，检查每个簇的效果。图3d显示簇AIV (包含八个在体外转染效率最低的DOTAP处方) 产生的平均生物发光信号（Luc 表达）比簇AI (包含八个在体外转染效率最佳的DOTAP处方)高17.2倍，表明体外转染效率高的簇不一定是体内表现最好的簇（图3b-d）。此外，结果表明辅助脂质的电荷显着影响转染效率；如阳离子脂质DOTAP比其他脂质更有效，但阳离子脂质DDAB转染效率较低。进一步使用流式量化肝脏内各种细胞类型中的mCherry表达水平（图3e）。单次肝内注射后，在所有前12个簇（如图3b虚线上方所示）中，肝脏中约 50% 的转染细胞是肝细胞，其次是免疫细胞。尤其簇AI和AII，在肝细胞中的转染效率分别高达73.9%和79.5%。该结果表明，这些簇包含可能具有有效的肝脏特异性转染的LNP制剂。因此，作者将前12个LNP簇确定为候选簇，以进一步评估它们在血液循环中的稳定性，以及全身递送后的组织特异性转染效率。

图4 集群模式筛选通过iv给药的LNP的体内转染效率

通过静脉注射进一步检查在肝脏中表现出最高转基因表达水平的12个簇的性能。相同的荧光素酶 (Luc) (50%)和mCherry (50%) pDNA被封装在这些LNP 中，以每只小鼠100 μg的总pDNA剂量静脉给药。12个簇中的3个簇（AII、AIV 和 DIV）在 iv 给药后显示出显着的毒性，被排除在进一步评估之外。5个簇（AI、CI、CII、DI 和 FIII）是肝脏特异性转基因表达最有效的簇（图4a-d）。通过 IVIS 成像测量，与其他簇相比，这五个簇在iv给药后12小时在肝脏中平均高出2到3个数量级的荧光素酶表达。结果（图4e，f）显示肝脏中约40%的转染细胞是肝细胞，肝细胞中约7%的总肝细胞肝脏被成功转染。进一步评估了前五个簇在其他组织（包括脾、肺、肾和心脏）中的转基因表达水平（图4g）。基于每个器官中的Luc的相对表达，图4h表明簇DI（89.6%的生物发光来自肝脏）和FIII（93.0%的生物发光来自肝脏）产生了较高的肝脏特异性转染效率。此外，在脾脏中，簇CI (45.2%)和CII (30.0%) 观察到更高水平的转基因表达。并进一步评估了肝、脾和肺中转染细胞的百分比；对于所有五个簇，基于mCherry表达，肝脏中大约10% 的细胞被转染（图4i）。基于这些数据，作者选择簇DI和FIII进行进一步表征。

图5 通过iv给药的LNP的肝脏靶向转染效率和体内基因编辑

为了进一步检查了簇DI和FIII内的16种单独LNP制剂的转染效率，作者使用相同的Luc/mCherry组合(50/50)的pDNA进行iv注射。IVIS结果表明（图5a-d），四种单独的制剂（DI-3、DI-8、FIII-7 和 FIII-8）在肝脏中显示出最高水平的Luc表达，最优处方FIII-7的 Luc 表达量比FIII-5高300倍。此外，还表征了上述四种制剂在其他主要组织中的转基因表达水平（图 5e）。图5f显示，FIII-7 73.9% 和DI-8 60.8% 的生物发光发生在肝脏中，两种制剂均显示出高水平的肝脏特异性转基因表达。

图6 表现最佳的 LNP 制剂的生物分布、细胞摄取和内体逃逸水平

接下来，作者对四种最优制剂（DI-3、DI-8、FIII-7 和 FIII-8）的机制作出如下假设并进行验证：增强的肝脏靶向转染是（1）LNPs的组织特异性生物分布，（2）LNPs分布到局部组织后细胞摄取差异，（3）LNP的不同内体逃逸或DNA释放能力的结果。文章中首先使用Cy5标记的pDNA在iv注射后6、12和24小时，检查了四种最优LNP和两种效果较差但具有与最优处方相似尺寸和zeta电位的LNP（DI-6 和 FIII-1）的血清稳定性和生物分布。IVIS成像显示（图6a），与转染性能无关，六种制剂在所有时间点都具有相似的生物分布曲线。此外，图6b表明，对于六种制剂，肝细胞的摄取水平相似。因此，最优处方的高转染不是由生物分布或细胞摄取水平的差异引起的。为了进一步验证 LNP的转染效率与生物分布无关，作者通过肝内注射施用相同剂量的六种LNP 来检查转染效率。图6c-d表明，虽然相同剂量LNP制剂被输送到肝脏，但局部转染效率有显着差异。与DI-6和FIII-1相比，最优的四种处方提供了更高的转染效率。因此，转染效率都与生物分布没有严格的关系。

为了验证内体逃逸和/或DNA释放提高了LNP制剂的转染效率，分离了原代小鼠肝细胞并用上述六种LNP包载75% GFP 25% Cy5标记的pDNA。为了模拟体内情况，将LNP与小鼠血清预孵育，结果表明六种LNP表现出相似的体外细胞摄取水平，这与体内细胞摄取水平一致（图 6e ）。然而，图6f-g显示最优的四种LNP制剂的转染效率大大提高；FIII-7在血清预孵育后，GFP阳性细胞的百分比增加了12倍，而DI-6和FIII-1的转染效率与最优LNPs相比没有显着差异增加。此外，通过对已建立的B16- Gal8 -GFP细胞系进行的定量 Cellomics高含量分析，检查了上述制剂的内体逃逸能力。结果如图6h显示最优四种制剂（DI-3、DI-8、FIII-7 和 FIII-8）具有相对较高的内体逃逸能力。

上述结果表明，具有相似粒径和zeta电位的LNP在iv注射后产生了相似的生物分布和细胞摄取曲线，但不同LNP制剂的不同内体逃逸能力可能是转染效率差异的决定因素。此外，在有或没有血清孵育的组之间观察到的显着差异表明，体内和体外实验之间的差异可能与血清介导的LNP调理作用密切相关。

图7 通过共同递送抗炎siRNA和pDNA LNP使转基因表达持续时间延长

接下来，静脉注射最优四种制剂（DI-3、DI-8、FIII-7 和 FIII-8）后监测小鼠肝脏内表达的持续时间（图7a-b），表达水平维持在与初始表达相似水平约4天，然后在3至7天后下降。

为了进一步延长pDNA的表达，作者测试了LNP共递送抗炎siRNA和pDNA的表达持续时间。图7c-e结果表明，当同时递送针对STAT1和NF-κB2的siRNA时，由FIII-7 LNP介导的荧光素酶表达持续了10天，而当相同LNP 单独递送pDNA时，荧光素酶表达仅持续了5天。此外，图7e显示肝脏内 FIII-7 (STAT1 NF-κB2) LNPs和FIII-7 (STAT1) LNPs 的表达水平在第2天分别比单独的FIII-7 LNP高3.4倍和2.2倍。给药7天，ELISA检测肝内STAT1和NF-κB2水平。如图7f显示，在静脉注射FIII-7 LNP后观察到两种炎症转录因子的水平升高；和抗炎siRNA的协同递送显着降低了转录因子水平。与单独注射FIII-7 LNP相比，FIII-7 (STAT1 NF-κB2) LNP 组中NF-κB2和STAT1的水平分别降低了~17.6%和~24.5%。此外，还观察到较低水平的浸润性炎性单核细胞（CD45 CD11b 细胞）和肝脏内的凋亡细胞（图7g）。因此，这些组合效应足以显着提高转基因表达水平并延长持续时间。

总结与讨论

总体而言，作者在文章中报告了一个多步骤组合物筛选平台，该平台能够从超过1000种处方的LNP文库中识别性能最佳的用于肝脏特异性转基因表达的pDNA LNP。并结合了体外和体内筛选策略，它可以扩展到其他载体系统，可能会用于各种给药途径。此外，作者发现，肝脏选择性LNP在肝脏中优先于其他器官/组织的转染与LNP的体内分布或细胞摄取效率没有直接关系。相反，包括溶酶体逃逸、DNA释放等在内的细胞内递送事件起着更关键的作用。因此，作者推断具有相似物理特征的LNP以相似的方式分布在不同器官中；但由于细胞内递送效率的差异，显示出不同细胞类型转染的组织特异性差异。最后，作者开发了一种创新策略，可共同提供抗炎siRNA和pDNA，以进一步延长pDNA的表达。这种基于LNP的共同递送策略进一步突出了使用 pDNA递送延长基因表达的独特优势，并为基于pDNA的医学应用提供了新的机会。

参考文献

1.Zhu Y. Shen R. Vuong I. Reynolds R. A. Shears M. J. Yao Z. C. Hu Y. Cho W. J. Kong J. Reddy S. K. Murphy S. C. & Mao H. Q. (2022). Multi-step screening of DNA/lipid nanoparticles and co-delivery with siRNA to enhance and prolong gene expression. Nature communications 13(1) 4282. https://doi.org/10.1038/s41467-022-31993-y.