磷酸锆载银抗菌机理（新型介孔磷酸锆的抗菌性能研究）

磷酸锆载银抗菌机理（新型介孔磷酸锆的抗菌性能研究）酵母：啤酒酵母(303)，糖化酵母(TH，酵母属野生酵母)、假丝酵母(JS，非酵母属野生酵母)。孳兰氏阴性菌(G－)：酶蟹盛(CS)，硫状菌(LZ)、大酶汗菌(DC);1、试菌及培养基供试菌(括号内为编号)革兰氏阳性菌(G )：短乳酸杆菌(DR)、有害片球菌(PQ)、枯草杆菌(KC)、金黄色葡萄球菌(JH)；

一、摘要

生物模板仿生合成的介孔磷酸锆通过表征测试证明有良好的性能。以革兰氏阳性茵(G )、苹兰氏阴性菌(G一)和酵母属真菌等10种微生物作为供试茵，抑菌圈试验(定性)和细胞总数测定实验(定量)作为实验方法研究了介孔磷酸锆的抗菌性，并探讨影响其抗菌性的因素和抗茵机理。实验结果显示，介孔磷酸锆对其中的8种茵具有明显的抑菌效果，但对各种茵的抗茵能力表现差异性。说明介孔磷酸锆具有较好的广谱抗菌性，将有广阔的应用前景。

磷酸铬是一类具有较好的热稳定性与良好的耐酸碱性能的材料，介孔磷酸锆类化合物成为当前研究的热点。介孔磷酸锆在其结构上可以分为α-ZrP和γ-ZrP两种结构类型，目前合成的大多数为α-ZrP，主要由于α型磷酸锆具有较好的催化及插层等性能，在催化、生物、光学、电学、环境保护等领域具有广阔的应用前景。在众多功能中，介孔磷酸锆材料本身具有的抗菌性能尚未见报道。载银磷酸锆复台材料的抗菌性仅以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌作为供试菌。

二、实验部分

1、试菌及培养基

供试菌(括号内为编号)

革兰氏阳性菌(G )：短乳酸杆菌(DR)、有害片球菌(PQ)、枯草杆菌(KC)、金黄色葡萄球菌(JH)；

孳兰氏阴性菌(G－)：酶蟹盛(CS)，硫状菌(LZ)、大酶汗菌(DC);

酵母：啤酒酵母(303)，糖化酵母(TH，酵母属野生酵母)、假丝酵母(JS，非酵母属野生酵母)。

培养基(括号内为编号和培养的菌株)

麦汁液体／琼脂培养基(MZ.啤酒酵母303、糖化酵母、假丝酵母)、MRS液体／琼脂S培养基(MRS 有害片球菌、短乳酸杆菌、硫状菌)、营养肉汤液体／琼脂培养基(YR 枯草芽孢杆菌、醋酸菌、金黄色葡萄球蕴)、LB液体／琼脂培养基(LB，大肠杆菌)。

2、原材料

酵母模板仿生合成的介孔磷酸锫，绵竹耀隆化工有限公司提供。

3、抗菌性测试

首先定性的(抑菌圈法)研究介孔磷酸锆的抗菌性，然后定量的考察抗菌性能的强度及影响抗菌性的因素。

菌悬液制备

在无菌操作条件下，分别挑取一环斜面培养供试菌接种于相应的液体培养基中，恒温培养箱25～37℃(每种供试菌有相应的温度)培养24h，已灭菌的生理盐水梯度稀释，调整菌悬液的浓度为106～107cfu／mL，备用。

抑菌圈法

将灭菌的的琼脂培养基加热融化，倒入已灭菌的培养皿中，制成平板。琼脂凝固冷却后取1ml。将菌悬液置于平板上，用三角玻璃刮涂布均匀，把多余菌悬液小心吸出，静置几分钟。设置空白对照。将培养皿置于26～37℃的恒温培养箱中，24h后，游标卡尺测量试样周围抑菌圈的大小，以抑菌圈直径的平均值作为评价材料抗菌性能的依据。

细胞总数测定法

细菌数量的测定，采用菌落计数法。通过测定参比样与抗菌材料处理样中细菌数量的增减来评价材料的抗菌性能。将菌悬液装入灭菌的锥形瓶中，加入一定量的介孔磷酸锆，再将锥形瓶置于气浴恒温振荡器中，2s～37℃培养一段时间后，测量剩余的活细菌总数。每个供试菌另有一瓶不加抗菌材料作为对照组。此方法以灭菌率作为指标定量评价材料的抗菌性能，计算公式如下：灭菌率=(实验前的活菌数-实验后的活菌数)／实验前的活菌数×100％(1)

三、结果与讨论

抑菌圈试验

酵母和细菌在培养皿中能够迅速生长，形成一层分布均匀的菌苔，但加入抗菌材料后酵母和细菌在其周围很难生长，在抗菌材料的周围会出现清晰透明的抑菌圈。抑菌圈直径越大表明材料的抗菌效果越好，反之则越差。

介孔磷酸锫对10种供试菌的抑菌圈试验结果如表l和图l所示。可以看出。303、TH、JS、KC、DC、JH表现出明显的抑菌圈，平均直径在12mm左右；PQ、Cs也有抑菌圈出现，但不是很明显DR、LZ则没有抑菌圈。这说明，介孔磷酸锆对303、TH、JS、KC、DC、JH有较强的抑制作用，对PQ、CS表现出抑制效果但相对较弱，对DR、LZ没有抑制作用。从而定性的证明了介孔磷酸锆有抗菌性能，且对菌种具有选择性。

细胞总数测定

表2结果显示：介孔磷酸锆添加量为0.75g／L时，作用8h，DC灭菌率达99．99％，8h以上可以全部杀灭；作用12h，303、TH、JS、KC、JH平均灭菌率达96％，16h为100％；作用24h，CS、PQ灭菌率为98％。添加量为1.25g／L，时，仅作用4h，DC灭菌率就达99.96％，8h为100％；作用8h，303、TH、JS、KC、JH灭菌率97％以上，16h时全部杀灭，此时CS、PQ灭菌率也达到90％。添加量为2.50时，作用4h，DC灭菌率是100％；303、TH、JS、KC、JH达到99％以上，8h是灭菌率100％；CS、PQ在16h时达到99.87％，24h为100％。从实验结果可知，介孔磷酸锆对DC杀灭作用最强，对303、THJS、KC、JH有较好的杀灭效果，但对CS、PQ在12h内效果不明显。添加量为0.75g／L，作用12h，介孔磷酸锆对酵母和多数细菌有理想的灭菌效果。

影响抗菌性的因素

影响介孔磷酸锆的抗菌性的因素有很多，本实验考察了以下4个影响因素：

（1）、制备工艺

反应物的浓度、模板量和热处理温度等因素对介孔材料的性能有着重要的影响。把比表面积作为目标参数，选择正交表L16(45)来设计正交实验。比表面积(BET)的测定可知酵母量和煅烧温度对结构性能影响最大，其他作用较小。正交试验结果显示磷酸锆最佳合成条件：酵母量0.4g，煅烧温度300℃，磷源浓度0.2mol／L，锆源浓度0.1mol／L，pH值=l。抑菌试验结果表明此结构的样品抗菌性能最好。

（2）、添加量和作用时间

表2实验结果表明，加大添加量，延长作用时间。灭菌率随之增高。但不同菌种对抗菌材料的敏感性不同，所以要根据菌种选择合适的添加量和作用时间。另外，在抑菌圈实验(图2)中发现，DC在恒温培养24h以后，抑菌圈内重新出现小菌落，并且随着时间逐渐扩大和增多，这说明介孔磷酸锆只是暂时抑制了DC的生长和繁殖，一旦抑制作用解除DC会重新生长。这种现象可能是因为部分DC在作用过程中对抑菌因子产生了“抗性”逐渐适应了新环境，同时水分的消耗妨碍抑菌因子的释放和抑制作用的发挥，菌落周围环境的抑制因子减少，抑制力减弱。

（3）、茵悬液浓度

菌悬液浓度是影响抗菌效果的一个重要因素。在一定范围内，菌悬液浓度对实验结果分析影响不大，较低浓度不能很好显示抗菌材料的抑菌能力，过高的浓度则可能超出抗菌材料的抑制能力，不能表现其抑菌效果。一般菌悬液浓度取106～107 cfu／mL。

（4）、材料状态

实验表明，介孔磷酸锆粉末表现出良好的抑菌效果，但相同条件下介孔磷酸锆压片抑菌效果较差，且作用时间较长，对一些供试菌甚至没有表现出抑菌性能(图3)。可能是因为高压挤压破坏了介孔磷酸锆的孔结构，孔径变小或堵塞，抑菌因子释放速度放缓或不能释放，对供试菌解除了抑制作用。

四、抗菌机理

纳米金属离子抗菌剂的抗菌作用属于被动式抗菌，通常情况下通过离子溶出后接触微生物来发挥抗菌作用。目前普遍认可的两种机理是接触反应机理和活性氧机理。

接触反应机理是金属离子通过液体溶出接触到微生物细胞，金属离子所带正电荷与微生物细胞膜所带负电荷中和，并在适当的条件下，通过微生物膜上某些具有运输功能的酶被转移到微生物机体内部，与机体内的蛋白质等物质发生反应，破坏了细胞内容物的结构和功能，造成微生物的生理系统障碍，抑制其正常生长甚至最终使其死亡。

活性氧机理认为．金属离子抗菌剂与微生物菌体接触以后，溶出的微量金属元素分布在抗菌剂表面会形成一个催化氧化活性中心。产生的强氧化还原性. OH和O2-损坏微生物的细胞成分，妨碍新陈代谢正常进行，抑制其生长繁殖，从而达到抑菌、杀菌的效果。

介孔磷酸锆属于纳米金属离子抗菌剂，其抗菌过程可以分为4个阶段：同微生物接触；同细胞膜相互作用并引起膜的透化；胞内杀死阶段；微生物死亡。锫离子同微生物接触是抑菌或杀菌过程的一个必要条件。锆离子与细胞膜接触后破坏了细胞膜的完整性同时造成内容物的泄露。这是介孔磷酸锆发挥抗菌作用最重要的过程之一。微生物细胞膜的通透性能允许锆离子进入细胞内部与重要功能分子反应。锆离子可能使DNA不再随机分布在核区，而是在核区浓缩成紧张态，破坏了DNA分子的复制能力，从而影响遗传物质正常的复制及生物体的繁殖；可能通过影响细胞的信号转导而使微生物不能正常地存活；可能通过产生自由基，进一步氧化细胞外膜使微生物死亡；极微小的粒径，可以进入微生物并与细胞中酶蛋白的巯基结合，使一些含巯基基团的酶失去活性；等等。总之，无论是破坏膜结构还是干扰内部代谢活动，或者几种效应相互作用，微生物的生长繁殖受到抑制，甚至完整的生命结构不复存在了，都会造成微生物的死亡。

五、结论

采用最优工艺，酵母模板仿生合成的介孔磷酸锆具有良好的广谱抗菌性。其抗菌性微生物具有选择性且抗菌效果表现出差异性。介孔磷酸锆的制备条件、添加量、存在状态、作用时间、菌悬液浓度等试验因素明显影响其抗菌性。目前，还没有有关磷酸锆抗菌性能的深入的研究，本方法对其抗菌机理做了初步分析，确定主要经过4个阶段达到抑菌或灭菌效果。作为一种新型纳米无机抗菌剂，介孔磷酸锆在生物领域环境保护领域将有广阔的应用前景，抗菌机理及其应用将是以后研究的重点。