如何检测转录因子活性（干货双荧光素酶报告基因检测如何助力转录因子研究）

如何检测转录因子活性（干货双荧光素酶报告基因检测如何助力转录因子研究）（1）报告基因质粒：将转录因子的调控元件克隆在Luciferase的上游，用来启动荧光素酶的表达；在检测过程中通常需要用到3个质粒：双荧光素酶报告基因研究转录因子的原理转录因子(transcription factor，TF)也称为反式作用因子，是指能够与真核基因的顺式作用元件发生特异性相互作用，并对基因的转录有激活或抑制作用的DNA结合蛋白。双荧光素酶报告基因检测转录因子时，一般分为两种，一种为研究转录因子是增强子（增强其调控原件的表达）或是抑制子（抑制其调控原件的表达）；另一种为研究其他因素如磷酸化[2]、分子物质（如nsp15[3]）等对转录因子活性的影响。

什么是双荧光素酶报告系统？

荧光素酶是对所有能够利用对应底物产生生物荧光的酶的统称。当底物充足时，发出的荧光量与酶活性呈正比，常见的荧光素酶有萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)、细菌荧光素酶（LuxAB）及海肾荧光素酶(Rellina Luciferase)三类如图1。

图1.常见的三类荧光素酶[1]

双荧光素酶报告基因检测系统（Dual-Luciferase Reporter Assay）由萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶组成。两种荧光素酶无需修饰，只要正常转录即具有活性，其中海肾荧光素酶作为转染的内参，来减少孔间细胞数量和转染效率对实验结果的影响，通过特定的荧光检测仪检测荧光量来判断酶的活性，进而反映基因间的关系。

双荧光素酶报告基因研究转录因子的原理

转录因子(transcription factor，TF)也称为反式作用因子，是指能够与真核基因的顺式作用元件发生特异性相互作用，并对基因的转录有激活或抑制作用的DNA结合蛋白。

双荧光素酶报告基因检测转录因子时，一般分为两种，一种为研究转录因子是增强子（增强其调控原件的表达）或是抑制子（抑制其调控原件的表达）；另一种为研究其他因素如磷酸化[2]、分子物质（如nsp15[3]）等对转录因子活性的影响。

在检测过程中通常需要用到3个质粒：

（1）报告基因质粒：将转录因子的调控元件克隆在Luciferase的上游，用来启动荧光素酶的表达；

（2）转录因子的表达质粒：用来表达转录因子；

（3）内参质粒：用来表达海肾荧光素酶。

将3个质粒共转染，如果该转录因子能够激活调控元件，则荧光素酶就会表达，且表达量与转录因子的作用强度成正比。

双荧光素酶报告基因检测的实验流程

➊查询靶基因的转录调控作用位点

可参考：干货|荧光素酶课堂衍生-带你寻找你的目的位点。

➋载体的选择与构建

预测到靶基因的调控元件后，通常需要制备重组载体，根据研究种类的不同，报告基因载体及表达载体也有所差异。

在研究转录因子是增强子或是抑制子时，需要构建报告基因载体和靶基因的表达载体（具体实验方案可参考案例1）。

研究其他分子对转录因子活性的影响时，需要构建报告基因载体和表达靶基因影响因素的载体（具体实验方案可参考案例2）。

图2.载体构建过程示意图

注：将载体进行线性化，对需要融合的片段进行酶切或加入同源臂处理，利用T4 DNA Ligase 或同源重组的方法将片段和载体融合，获得重组载体；在载体构建过程中推荐使用同源重组方法，同源重组方法不受酶切位点的限制，且可以一次性实现多个片段的融合，操作简单，用时更短。

➌转染

根据细胞的特点选用合适的转染方法将实验组（报告基因载体/表达载体/PRC-TK载体）及对照组（报告基因载体/表达空载体/PRC-TK载体）进行转染。

➍细胞裂解及荧光检测

细胞培养液中加入裂解Buffer，随后离心取上清，在上清液中加入萤火虫荧光素酶反应液，检测萤火虫荧光素发光，随后加入海肾荧光素酶反应液，检测腔肠素发光。检测过程如图3，记录荧光值。

图3.荧光检测示意图

➎结果分析

计算每管的Firefly Luciferase/Renilla Luciferase的比值，再以对照组的比值作为单位1，获得实验组的相对活性。

案例分析[4]

实验目的：检测ZmNAC49是ZmMUTE转录的激活子还是抑制子

实验方案：采用无缝克隆的方法将ZmMUTE的启动子克隆到p1381-LUC载体中，构建报告基因载体(Reporter)，随后用同样的方法将转录因子ZmNAC49克隆到启动子Ubi下游，构建靶基因表达载体(Effector)。载体示意图见图4。将实验组报告基因载体、靶基因表达载体和TK载体及对照组报告基因载体、空白对照载体(Control)和TK载体利用农杆菌转化法转化至烟草叶片中，培养72 h。测定LUC 和 REN信号，LUC 和 REN 活性代表启动子的相对活性。

图4.载体构建示意图

实验结果：报告基因载体存在时，相对LUC活性低于对照组。表明ZmNAC49直接与ZmMUTE启动子结合，作为ZmMUTE的转录抑制因子。

图5.采用双荧光素酶法测定LUC/REN比值

案例分析2[3]

实验目的：研究nsp15对转录因子NF-kB活性的影响

实验方案：采用双荧光素报告基因检测系统检测nsp15对转录因子NF-kB的作用，NF-kB具有一定的活性，不需要激活。该实验在报告基因的前端融合转录因子NF-kB，构建重组载体。在实验组转染不同浓度的nsp15真核表达质粒、重组载体NF-kB-Leu及PRL-TK；对照组转染真核表达空质粒、重组载体NF-KB-Leu及PRL-TK。用脂质体的方法将载体转染至LLC-PK1、HEK-293T两种细胞，转染12 h后加入SEV，共培养12 h后，进行双荧光素酶检测。

实验结果：在LLC-PK1及HEK-293T两种细胞中，SEV诱导下的荧光强度明显高于无SEV诱导；在nsp15存在时，荧光强度明显下降且呈现浓度依赖性。在LLC-PK1细胞中最为明显如图6。表明nsp15显著抑制SEV诱导的NF-kB激活，且抑制程度与浓度呈正比。

图6.在两种细胞中添加不同浓度nsp15时检测到的荧光值

A：在LLC-PK1细胞中添加不同浓度的nsp15时的荧光值；

B：在HEK-293T细胞中添加不同浓度的nsp15时的荧光值

【参考文献】

[1] Campbell AK. Chemiluminescence: Principles and Applications in Biology and Medicine［M]. Ellis Horwood，1988.

[2] Zhou W Yao J Wang G Chen Z Li Z Feng D Li Y Qasim W Tan W Ning S Tian X. PKCζ phosphorylates TRAF2 to protect against intestinal ischemia-reperfusion-induced injury. Cell Death Dis. 2017 Jul 20;8(7):e2935.

[3] 刘晓蓉. 猪δ冠状病毒非结构蛋白nsp15抑制IFN-β产生的机制研究[D]. 华中农业大学.

[4] Xiang Y Sun X Bian X et al. ZmNAC49 reduces stomatal density to improve drought tolerance in maize[J]. Journal of Experimental Botany 2020.