水稻crispr载体：水稻免疫反应Raf类蛋白激酶与丝裂原活化蛋白激酶信号级联调控

水稻crispr载体：水稻免疫反应Raf类蛋白激酶与丝裂原活化蛋白激酶信号级联调控OsEDR1的蛋白序列中含有大量的MAPK的识别位点，作者推测OsEDR1会被OsMPK6磷酸化。通过体外磷酸化结合质谱分析，发现OsEDR1激酶区的 S861位点是OsMPK6的主要磷酸化位点。进一步的分析发现，在野生型水稻中，该位点的磷酸化发生于Xoc侵染后。同时，该位点的磷酸化也存在于OsMPKK10.2的超量表达植株中，且依赖于OsMPK6。而当OsMPKK10.2 S304位点发生磷酸化时，OsEDR1 S861位点的磷酸化也会发生。这些结果表明OsMPKK10.2-OsMPK6被病原菌激活后，会磷酸化OsEDR1。在另外一个平行进行的实验中，作者发现OsEDR1（拟南芥EDR1的同源蛋白）与OsMPKK10.2物理上互作，但是在真核细胞中表达的OsEDR1蛋白在体外并不磷酸化OsMPKK10.2。该课题组已经发表的工作表明，OsEDR1负向调控水稻对细菌性病害的抗性，且osed

Mol Plant | 华中农业大学研究揭示水稻免疫反应Raf类蛋白激酶与丝裂原活化蛋白激酶信号级联的相互调控机制

来源 | Mol Plant

2021年1月13日，华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室王石平教授课题组在Molecular Plant上发表了题为“Pathogen-inducible OsMPKK10.2-OsMPK6 cascade phosphorylates the Raf-like kinase OsEDR1 and inhibits its scaffold function to promote rice disease resistance”的研究论文，揭示了水稻免疫反应中一个Raf类蛋白激酶与丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号级联之间的相互调控机制，为理解Raf类蛋白激酶的功能和作用机制提供了新的视角。

植物的很多生理活动，包括免疫反应，都有MAPK信号级联的参与。一个完整的MAPK信号级联包含三个激酶，MAPKKK（MAPK kinase kinase），MAPKK（MAPK kinase）和MAPK。MAPK信号级联通过依次磷酸化的方式将细胞外信号传递到细胞内。MAPKKK响应外界信号而被磷酸化，进而磷酸化MAPKK特定基序（S/T-X3-5-S/T; X代表任意氨基酸，数字代表间隔的氨基酸数目）中的丝氨酸（S）/苏氨酸（T），从而激活MAPKK；激活的MAPKK随后磷酸化MAPK特定基序（T-X-Y）中的苏氨酸和酪氨酸（Y），从而激活MAPK。激活的MAPK磷酸化特定底物（包括转录因子，酶等），使细胞对外界信号产生相应的反应。

同酵母和动物相比，植物中MAPKKK的数量相对较多，可以简单地分成两类：MEKK类和Raf类。其中，Raf类的数量相对较多。比如，水稻中有75个类似MAPKKK的激酶，Raf类的数量为43个。

MEKK类的MAPKKK以正常的方式调控MAPK信号级联，即直接磷酸化并激活MAPKK，进而激活MAPK。比如，拟南芥中至少有两个完整的MAPK信号级联参与调控免疫反应，即MEKK1-MKK1/MKK2-MPK4和MAPKKK3/MAPKKK5-MKK4/MKK5-MPK3/MPK6。其中的MEKK1和MAPKKK3/MAPKKK5都属于MEKK类激酶，它们被胞质类受体激酶磷酸化后，直接磷酸化并激活对应的MAPKK。

Raf类的MAPKKK也参与调控植物的MAPK信号级联。拟南芥中有两个比较有名的Raf类MAPKKK，CTR1和EDR1。CTR1负向调控MKK9-MPK3/MPK6信号级联，进而调控植物的乙烯信号路径。EDR1负向调控MKK4/MKK5-MPK3/MPK6信号级联，进而调控植物的先天免疫。其中，EDR1的作用机制解析得相对清晰。EDR1通过其氨基端与MKK4/MKK5物理互作，并负向调控MKK4/MKK5的蛋白积累；同时，EDR1抑制一个E3泛素连接酶的磷酸化，从而抑制MKK4/MKK5的蛋白积累。从这些结果中可以看出，在植物的MAPK信号级联中，Raf类MAPKKK的作用方式同MEKK类不同。

该研究从水稻的一个MAPKK，即OsMPKK10.2入手。前期的结果发现OsMPKK10.2-OsMPK6信号级联正向调控水稻对细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola Xoc）的抗性。OsMPKK10.2是一个结构上非典型的MAPKK，其蛋白序列中潜在的被MAPKKK磷酸化的基序是残缺的，因此OsMPKK10.2的完全激活可能需要其它位点的磷酸化。作者利用质谱，鉴定到了水稻接种Xoc后OsMPKK10.2上的磷酸化位点，其中一个位点，即304位的S所在的基序符合AGC激酶的底物特征。将S304突变成天冬氨酸（D）以模拟该位点的磷酸化状态，之后将这种形式的OsMPKK10.2在野生型中超量表达，发现转基因水稻对Xoc表现出抗病表型，同时体内OsMPK6被激活，OsWRKY45（OsMPK6的底物）的表达量也升高，水稻叶片上出现肉眼可见的细胞死亡（称为假病斑）现象，也累积了大量的H2O2。这些结果表明S304位点的磷酸化对于激活OsMPKK10.2以及后续的免疫反应非常重要。

在另外一个平行进行的实验中，作者发现OsEDR1（拟南芥EDR1的同源蛋白）与OsMPKK10.2物理上互作，但是在真核细胞中表达的OsEDR1蛋白在体外并不磷酸化OsMPKK10.2。该课题组已经发表的工作表明，OsEDR1负向调控水稻对细菌性病害的抗性，且osedr1突变体的叶片上会产生假病斑现象。因此，在水稻的免疫反应中，OsEDR1与OsMPKK10.2可能位于同一信号路径中。生化分析发现，与野生型相比，OsMPKK10.2 S304位点的磷酸化在osedr1突变体内增强，同时OsMPKK10.2的活性也增强，相应地OsMPK6的活化以及OsWRKY45的表达也增强，这些变化在接种Xoc后更明显；而在osedr1突变体的互补植株中，OsMPKK10.2的磷酸化和激酶活性，以及OsMPK6的活化和OsWRKY45的表达则与野生型中的类似。利用CRISPR/Cas9技术在osedr1突变体中敲除OsMPKK10.2，双突变体表现出同野生型类似的抗病表型，假病斑现象同osedr1突变体相比减弱；而osedr1/osmpk6的双突变体则对Xoc表现出感病表型，且叶片上没有出现假病斑现象。这些结果表明OsEDR1抑制了OsMPKK10.2-OsMPK6信号级联的激活，也表明OsMPKK10.2并不是唯一一个作用于OsEDR1下游的MAPKK，同时也表明细胞死亡与免疫反应并不是完全偶联的。

OsEDR1的蛋白序列中含有大量的MAPK的识别位点，作者推测OsEDR1会被OsMPK6磷酸化。通过体外磷酸化结合质谱分析，发现OsEDR1激酶区的 S861位点是OsMPK6的主要磷酸化位点。进一步的分析发现，在野生型水稻中，该位点的磷酸化发生于Xoc侵染后。同时，该位点的磷酸化也存在于OsMPKK10.2的超量表达植株中，且依赖于OsMPK6。而当OsMPKK10.2 S304位点发生磷酸化时，OsEDR1 S861位点的磷酸化也会发生。这些结果表明OsMPKK10.2-OsMPK6被病原菌激活后，会磷酸化OsEDR1。

作者将OsEDR1 S861位点突变为丙氨酸（A），使该位点不能够被磷酸化。将这种形式的OsEDR1（OsEDR1S861A）转入osedr1突变体内，转基因植株对Xoc 表现出感病表型，且叶片上没有出现假病斑现象，同时，OsMPKK10.2-OsMPK6信号级联的激活也受到了抑制。进一步的研究发现，OsEDR1S861A依然可以与OsMPKK10.2物理上互作。此外，Xoc侵染后，OsEDR1会被降解，而OsEDR1S861A则不容易被降解，表明S861位点的磷酸化促进了病原菌诱导的OsEDR1的降解。

作者由此推断（图1），OsEDR1通过与一部分OsMPKK10.2互作，抑制了后者的激活；当病原菌入侵时，OsMPKK10.2 S304位点被未知的激酶磷酸化，进而激活OsMPK6。后者磷酸化OsEDR1的S861位点，促进OsEDR1的降解，从而释放更多的OsMPKK10.2，使得OsMPKK10.2-OsMPK6信号级联的激活被放大，进而增强水稻的免疫反应。这些结果表明，在OsMPKK10.2-OsMPK6信号级联的调控中，OsEDR1以一个脚手架蛋白（scaffold protein）的形式参与其中。

图1. 水稻免疫反应中，OsEDR1与OsMPKK10.2-OsMPK6信号级联之间的相互调控关系。

上述分子机制在真核生物中是一种普遍的调控机制。在酵母中，Ste5是一个脚手架蛋白，调控MAPK信号级联Ste11-Ste7-Fus3；Fus3（一个MAPK）通过反馈磷酸化Ste5，降低MAPK信号级联的信号输出。在哺乳动物细胞中，KSR1是一个脚手架蛋白，调控MAPK信号级联Raf-MEK-ERK；ERK（一个MAPK）通过反馈磷酸化KSR1，切断MAPK信号级联的激活。在拟南芥中，病原菌侵染后，两个MAPK信号级联MAPKKK3/5-MKK4/5-MPK3/6和MEKK1-MKK1/2-MPK4中的MPK6和MPK4，分别反馈磷酸化MAPKKK5和MEKK1，增强MAPK的活化。因此，该研究的结果再次表明，MAPK通过磷酸化信号级联中的脚手架蛋白或MAPKKK进而调节信号输出的方式在真核生物中是保守的。

当然，有很多重要的问题依然悬而未解。比如，Raf类MAPKKK的激酶活性存在的意义是什么？其被下游的MAPK磷酸化后，激酶活性是否发生了变化？一些比较重要的研究发现，植物中的Raf类MAPKKK磷酸化SnRK2，调控植物的非生物胁迫响应，这似乎意味着植物中Raf类MAPKKK的出现是为了适应逆境胁迫。但是Raf类MAPKKK是如何识别非MAPKK的底物的？其激酶活性的开启与否又是怎样被调控的？这些都值得进一步的探索。

华中农业大学王石平教授为该论文的通讯作者，博士后、Research Associate马海港为该论文的第一作者和共同通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金面上项目和青年科学基金项目，以及华中农业大学自主科技创新基金的资助。

论文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1674205221000083