：一日上线两篇Nature都讲光酶催化

：一日上线两篇Nature都讲光酶催化随后，该团队考察了EnT1.3催化不对称[2 2]-环加成反应的底物范围（图4），结果显示大多数底物都能以良好的转化率和选择性得到相应的环加成产物（2a-13a），尽管含有偕二甲基的底物（3、8和12）会导致对映选择性降低，这可能是由于EnT1.3的活性位点和底物1之间具有高度的形状互补性。事实上，进化程度较低的EnT1.2能提高3和12的转化率和选择性，而EnT1.1 A229S Y37L则能有效地催化底物8。对于N-甲基喹诺酮底物13而言，EnT1.3催化的反应得到了13a（2:1 r.r.，36% e.e.）及其区域异构体13b的混合物。为此，该团队向EnT1.3中引入Y121F突变并通过定向进化确定了S271C取代，最终以8:1 r.r.和98% e.e.值获得产物13a，这表明光酶的催化能力可以通过调控蛋白质的活性位点得到改善，并能实现一些现有小分子光催化剂难以进行的选择性转化。

本文来自X-MOLNews

近期，Nature 在同一天上线了两篇关于光酶催化[2 2]环加成反应的文章，分别是英国曼彻斯特大学Anthony P. Green教授团队的“A Designed Photoenzyme for Enantioselective [2 2]-Cycloadditions” [1]，以及华中科技大学钟芳锐教授、吴钰周教授团队和西北大学陈希教授团队合作的“Enantioselective [2 2]-cycloadditions with triplet photoenzymes” [2]。两篇文章都提到了“三重态光酶”概念，并将其成功应用于光化学对映选择性[2 2]环加成反应。

[2 2]-环加成反应是经典的光化学反应之一，可用于四元环化合物的构建，但是[2 2]-环加成反应由于基态轨道对称性不匹配，因而是热禁阻反应（图1A）。近年来，化学家通过能量转移（EnT）催化可实现各种光化学转化，其作用机制如下（图1B）：首先，三重态光敏剂在光激发下由基态（S0）跃迁至单重激发态（S1），后者通过系间窜越（ISC）转化至三重激发态（T1）。由于T1→S0的跃迁过程是自旋禁阻的，因此T1相对于S1具有更长的寿命。随后，通过能量转移将光敏剂从T1态返回S0，同时将底物由S0激发至具有高反应性的T1态，后者可进行各种分子内/分子间反应。另一方面，化学家通过将非手性光敏剂和非光敏性手性催化剂相结合（图1C）或者直接使用手性光敏剂（图1D），成功地开发了一系列不对称光化学反应，但是这些反应通常对氧敏感，同时需要较高的催化剂负载量并且底物范围局限。相比之下，酶催化剂具有难以企及的高催化活性，而且通过定向进化还可以改造这些活性位点以最大限度地提高蛋白、底物和光敏剂之间的相互作用，从而得到高效、高选择性的光催化剂（图1E）。尽管目前已报道了少数天然光酶和工程酶，但介导对映选择性EnT过程的酶却尚未见诸报道。

图1. [2 2]-环加成的光化学。图片来源：Nature

Anthony P. Green教授研究团队以Diels-Alderase DA_20_00为主体骨架，将基因编码的光敏剂安装到DA_20_00的β-螺旋桨框架中，从而将Diels-Alderase转化为用于[2 2]环加成反应的光酶催化剂（EnT1.0）。基于定向进化，该团队随后开发了一种高效且高对映选择性的酶催化剂（EnT1.3，TON>300，高达99% e.e.），可促进分子内和双分子环加成反应，甚至还能实现小分子催化剂难以进行的转化，并且可以在有氧条件和室温下有效运行。

首先，该团队选择喹诺酮1为分子内[2 2]-环加成反应的模型底物、二苯甲酮（BP）为光敏剂（图2B、2C），在光照条件下进行反应时得到了外消旋直链产物1a和交叉链产物1b的混合物（两者比为1.4：1）。引入注意的是，将4-苯甲酰基苯基丙氨酸（BpA）作为光敏剂通过基因工程引入DA_20_00疏水空腔内的173位，就可以得到第一代活性光酶EnT1.0（图2A），其催化活性和选择性均优于BP，产物1a和1b的比例提高到2：1，同时主产物(-)-1a的e.e.值达到46%。

图2. 第一代光酶EnT1.0的开发。图片来源：Nature

为了提高 EnT1.0 的催化活性，该团队将 BpA173附近的 8个残基突变为丙氨酸。其中M90A突变使得催化活性大幅提升（1a的产率增加3倍），同时e.e.值提升到60%（光酶EnT1.1）。随后，该团队进行了定向进化和高通量筛选，成功地发现了光酶EnT1.3，其活性、稳定性和选择性都显著提高（图3B），其中转化率提高了10倍、选择性提高至9：1，同时主产物(-)-1a的e.e.值超过99%（图3C、图3D）。有趣的是，EnT1.3在4 °C下比室温下的催化活性更高，这可能是由于低温能提高光敏剂三重态的寿命所致。另外，相比于三重态易被氧气淬灭而失活的小分子光敏剂，EnT1.3则可以耐受有氧缓冲液（图3D），并具有较高的TON值（>300）。事实上，仅使用1.5 mol% EnT1.3，1就能在2 h内几乎完全转化为光学纯的(-)-1a，这进一步凸显出该光酶的优异催化效率。

图3. 高效和对映选择性光酶的定向进化。图片来源：Nature

随后，该团队考察了EnT1.3催化不对称[2 2]-环加成反应的底物范围（图4），结果显示大多数底物都能以良好的转化率和选择性得到相应的环加成产物（2a-13a），尽管含有偕二甲基的底物（3、8和12）会导致对映选择性降低，这可能是由于EnT1.3的活性位点和底物1之间具有高度的形状互补性。事实上，进化程度较低的EnT1.2能提高3和12的转化率和选择性，而EnT1.1 A229S Y37L则能有效地催化底物8。对于N-甲基喹诺酮底物13而言，EnT1.3催化的反应得到了13a（2:1 r.r.，36% e.e.）及其区域异构体13b的混合物。为此，该团队向EnT1.3中引入Y121F突变并通过定向进化确定了S271C取代，最终以8:1 r.r.和98% e.e.值获得产物13a，这表明光酶的催化能力可以通过调控蛋白质的活性位点得到改善，并能实现一些现有小分子光催化剂难以进行的选择性转化。最后，该团队还探索了EnT1.3在2-喹诺酮和甲基乙烯基酮/乙基乙烯基酮的分子间[2 2]-环加成反应中的应用，分别以97% e.e.值得到光学纯产物14和15。

图4. 底物范围。图片来源：Nature

为了深入了解 EnT1.3 的催化机制，该团队解析了产物(-)-1a与C-末端截短类似物（EnT1.3ΔC310-314）的晶体结构（图5），结果显示Trp244可能在控制反应选择性上发挥着重要作用，其通过构建活性位点空腔来抑制环外烯烃加成到激发态喹诺酮的对映异位面，从而有利于(-)-1a的生成；而W244A突变则会导致催化活性显著降低并形成大量外消旋产物。

图5. (-)-1a与EnT1.3ΔC310-314的配合物晶体结构。图片来源：Nature

华中科技大学钟芳锐教授、吴钰周教授团队和西北大学陈希教授团队选择多药耐药调节因子LmrR作为光酶开发的蛋白质框架，这种蛋白质在其二聚体界面处具有一个大的疏水结合口袋。该团队将二苯甲酮类三重态光敏剂（能够对映诱导激发态）通过基因密码子拓展技术定点插入到LmrR蛋白的手性空腔中，构建了含非天然催化活性中心的人工光酶TPe。经过四轮定向进化，该团队获得了结构优化的光酶TPe4.0，能够实现吲哚衍生物的对映选择性分子内[2 2]光环加成反应（图6c），并且具有良好的底物适用性和优异的对映选择性（高达99% e.e.）。

图6. 对映选择性[2 2]环加成三重态光酶（TPe）的设计。图片来源：Nature

该团队选择吲哚衍生物1a的分子内[2 2]光环加成为模型反应（图7a），当使用二苯甲酮为光敏剂时，能以91%的产率得到所需产物2a（图7d）。随后，该团队将二苯甲酮类光敏剂通过基因密码子拓展技术定点插入到选定蛋白的手性空腔中，构建了含非天然催化活性中心的人工光酶TPe（图7b、7c），在经过三轮定向进化后，该团队发现TPe3.0（5 mol%）在4 ℃下能以85%的产率和90%的e.e.值获得产物2a，但是TPe3.0具有明显的底物特异性，吲哚环上带有取代基的底物（2h、2m、2n）的对映选择性较差。为此，该团队通过TPe3.0-1b复合物的晶体结构来探究底物和光酶之间的相互作用，发现立体化学可能源于光敏剂和氨基酸残基与底物之间的非共价相互作用。然后，该团队对TPe3.0进行优化，并获得了优异的突变体TPe4.0_FbpA（产率：93%，e.e.值：91%）。

图7. TPe的定向进化。图片来源：Nature

随后，该团队评估了三重态光酶催化的底物范围（图8），结果显示C2位（2a-2f）或者苯环上（2h-2n）带有不同基团的吲哚衍生物均能高效地实现分子内[2 2]光环加成反应，以优异的产率和对映选择性得到所需产物，特别是产物2a、2b、2m还能进行10 mg级规模合成。另外，含偕二甲基的吲哚衍生物1o也能以80%的产率和93%的e.e.值得到产物2o，后者含有4个相邻的季碳中心。需要指出的是，在某些情况下还可以通过直接光激发（采用弱光强或长波长照射）来减弱竞争性背景反应（2e-h、2n-o）。对于e.e.值<90%的底物（2h、2g、2j、2k、2n），该团队进一步优化了酶结构，例如：TPe3.0_FBpA_L96V更适合底物1j和1k；而TPe4.0_FBpA_V99C能将5-氟吲哚产物2n的对映选择性提高至91%。有趣的是，TPe4.0_FBpA还能实现其它类型N-Boc吲哚底物（如：吲哚-2-羧酸衍生物1p）的光环加成反应（产率：92%，e.e.值：57%）。

图8. 底物范围。图片来源：Nature

以上两项研究“英雄所见略同”，将光催化剂与蛋白质结合带来新的反应模式，从根本上扩大了酶催化的应用范围。可以预见，三重态光酶有望成为多种有价值对映选择性光化学转化的通用解决方案

A Designed Photoenzyme for Enantioselective [2 2]-Cycloadditions

Jonathan S. Trimble Rebecca Crawshaw Florence J. Hardy Colin W. Levy Murray J. B. Brown Douglas E. Fuerst Derren J. Heyes Richard Obexer Anthony P. Green

Nature 2022 DOI: 10.1038/s41586-022-05335-3

Enantioselective [2 2]-cycloadditions with triplet photoenzymes

Ningning Sun Jianjian Huang Junyi Qian Taiping Zhou Juan Guo Langyu Tang Wentao Zhang Yaming Deng Weining Zhao Guojiao Wu Rongzhen Liao Xi Chen Fangrui Zhong Yuzhou Wu

Nature. 2022 DOI: 10.1038/s41586-022-05342-4

参考资料：

华中科技大学报道：

http://chem.hust.edu.cn/info/1052/9993.htm