细菌的染色技术实验报告结果：rDNA测序技术对细菌性眼内炎房水和玻璃体标本中细菌的鉴别作用
细菌的染色技术实验报告结果：rDNA测序技术对细菌性眼内炎房水和玻璃体标本中细菌的鉴别作用1【关键词】眼内炎/微生物学；房水/微生物学；玻璃体/微生物学；细菌DNA/分析；测序分析，DNA；16S rDNA【DOI】10.3760/cma.j.issn.2095-0160.2016.10.004【基金项目】国家自然科学基金项目（81370996）；山东省重点研发计划（省攻关）项目（2015GSF118070）【摘要】 背景 眼内炎是多种内眼手术的严重并发症，以往感染菌的确定多采用细菌培养和涂片染色法，但存在花费时间长和阳性率低的问题。16S rDNA是细菌染色体上编码rRNA的序列，利用16S rDNA分子测序技术检测细菌具有高度的特异性。 目的 利用16S rDNA测序技术对细菌性眼内炎房水和/或玻璃体标本中的感染菌进行鉴定，探讨该技术在眼部感染性炎症诊断中的作用。 方法 于2015年6—12月收集在青岛眼科医院临床诊断为细菌性眼内炎的患者5例5眼，抽取每例患者的房水0.1～
实验研究
16S rDNA测序技术对细菌性眼内炎房水和玻璃体标本中细菌的鉴别作用
杨宝霞 李虹 孔凡芳 黄钰森
【作者单位】266071 青岛，山东省医学科学院 山东省眼科研究所 青岛眼科医院/山东省眼科学重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地
【通信作者】黄钰森，Email：huang_yusen@126.com
【DOI】10.3760/cma.j.issn.2095-0160.2016.10.004
【基金项目】国家自然科学基金项目（81370996）；山东省重点研发计划（省攻关）项目（2015GSF118070）
【摘要】 背景 眼内炎是多种内眼手术的严重并发症，以往感染菌的确定多采用细菌培养和涂片染色法，但存在花费时间长和阳性率低的问题。16S rDNA是细菌染色体上编码rRNA的序列，利用16S rDNA分子测序技术检测细菌具有高度的特异性。 目的 利用16S rDNA测序技术对细菌性眼内炎房水和/或玻璃体标本中的感染菌进行鉴定，探讨该技术在眼部感染性炎症诊断中的作用。 方法 于2015年6—12月收集在青岛眼科医院临床诊断为细菌性眼内炎的患者5例5眼，抽取每例患者的房水0.1～0.2 ml或玻璃标体标本0.5～1.0 ml，各取50 μl用于高通量测序，剩余标本行涂片检查和细菌培养。采用 D3096-01微量DNA试剂盒提取标本中细菌DNA，对收集的标本DNA样品进行16S rRNA基因V3-V4区PCR扩增，应用MiSeq 300测序仪对扩增的16S rDNA高变区序列进行测序，分析标本中病原菌的分类组成、分布特点以及各病原菌在标本中的相对含量，取50 μl无RNA酶水于一次性无菌离心管内作为空白对照。 结果 共收集到5份房水或玻璃体标本，涂片染色结果阳性者2例，外伤性细菌性眼内炎为革兰阳性杆菌，滤过泡感染性细菌性眼内炎为革兰阴性杆菌，而细菌培养法结果均为阴性。16S rDNA测序技术发现，5例标本检测阳性率为100%。外伤性细菌性眼内炎标本中高丰度菌属为葡萄球菌属、链球菌属和假单胞菌属，分别占65.28%、18.90%和12.76%；白内障术后2 d急性细菌性眼内炎患眼标本中高丰度菌属有假单胞菌属、不动杆菌属和Limnobacter菌属，分别占53.68%、8.62%和5.96%；滤过泡感染性细菌性眼内炎标本中高丰度菌属有莫拉菌属和假单胞菌属，分别占88.89%和 9.52%；白内障术后22 d迟发性细菌性眼内炎标本中相对含量较高的菌属有假单胞菌属，占84.63%；白内障术后1 d急性细菌性眼内炎患眼标本中相对含量较高的有假单胞菌属，占97.89%。 结论 16S rDNA测序可准确鉴别眼内炎患者房水和玻璃体标本中的致病菌，该方法检测的阳性率明显高于传统的涂片染色法和细菌培养法。
【关键词】眼内炎/微生物学；房水/微生物学；玻璃体/微生物学；细菌DNA/分析；测序分析，DNA；16S rDNA
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资料与方法
1.1 标本采集 纳入2015年6—12月于青岛眼科医院临床诊断为细菌性眼内炎的患者5例5眼，其中男4例，女1例；年龄24～77岁；包括外伤性细菌性眼内炎、白内障术后2 d急性细菌性眼内炎、青光眼滤过手术后滤过泡感染性细菌性眼内炎、白内障术后22 d迟发性细菌性眼内炎和白内障术后1 d急性细菌性眼内炎各1例，根据患者病史及患眼视力明显下降、眼部疼痛、眼分泌物增多、眼睑肿胀、角膜水肿、结膜充血和水肿、前房渗出或积脓、玻璃体炎性混浊、视网膜表面脓液附着等确诊。按照眼科检验协助组制定的《感染性眼病细菌学检查操作专家共识（2105）》取样原则及操作规范[8]，在患眼进行前房灌洗、玻璃体注药或者玻璃体切割前采集房水0.1～0.2 ml或玻璃体标本0.5～1.0 ml，每眼各取50 μl标本以提取标本组细菌DNA并行高通量测序，剩余标本用于涂片、细菌培养等常规病原学检测。取50 μl无RNA酶水于一次性无RNA酶离心管内作为空白对照。
1.2 高通量测序
1.2.1 病原体DNA的提取按照D3096-01微量DNA试剂盒（美国OMEGA公司）说明书的操作步骤提取标本细菌总DNA，保存于-80 ℃容器中备用。DNA标本在冷藏条件下送至杭州联川生物技术有限公司进行测序及生物信息分析。
1.2.2 16S rDNA的测序用细菌引物319F和860R（杭州联川生物技术有限公司）（上游引物：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'，下游引物：5'-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3'）对收集的标本DNA进行16S rRNA基因V3-V4区PCR扩增，然后回收电泳DNA片段，构建文库，制备成簇；应用MiSeq 300测序仪（美国Illumina公司）对扩增的16S rDNA高变区序列进行测序，测序区域为V3-V4区，长度为469 bp，测序类型为300PE。
1.2.3 物种分类和丰度分析原始测序数据归一化处理后获取过滤后的有效数据，拼接成类别的标签后将重叠区域约90 bp的片段组装成高质量的300 PEs，组装的序列通过应用聚类软件CD-hit-est（http://cd-hit.org）进行去冗余序列分析[9]。利用软件PyNAST（http:/qiime.org/pynast/）分析计算每个样本的序列数量及可操作的分类单元（operational taxonomic units，OTU），其中相似性大于97%的序列定义为一个OTU。利用核糖体数据库项目分类器[Ribosomal Database Project（RDP）Classifier] 对所有OTU代表序列进行物种分类分析[10]，基于OTU的结果绘制稀疏曲线[11]，计算单个样本Alpha多样性值，包括Shannon指数、Simpson指数和Chao1指数。Shannon 指数和Chao1指数值越大表示该环境的物种越丰富，Simpson指数越接近于0表示物种越丰富。
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结果
2.1 患眼标本的常规病原学检测
2例标本的涂片检测结果呈阳性，其中外伤性细菌性眼内炎标本中感染菌为革兰阴性杆菌，青光眼滤过术后滤过泡感染眼标本感染菌为革兰阳性杆菌。5例患眼标本的细菌培养结果均为阴性。
2.2 16S rDNA高通量测序技术检测
2.2.1 测序结果及取样深度验证标本收集过程中用于监测污染的无RNA酶水标本未检测到细菌DNA，证实标本收集及DNA提取过程无污染。各标本高通量测序的数据统计结果显示，5例眼内炎标本共获得149 858条优化序列，平均长度为469 bp；5例标本共产生4 403个OTUs（表1）。
2.2.2 稀疏曲线稀疏曲线可见5个标本稀疏曲线均基本趋于平缓（图1），说明测序深度较好，基本覆盖了标本的所有菌落，较真实地反映出眼内炎致病菌的细菌群落。
图1 5例眼内炎标本中微生物群落的稀疏曲线 OTU：可操作的分类单元；yny：眼内眼
2.2.3 检出细菌的在门水平5例眼内炎标本共检出13个菌门。组成致病菌群落的149536条序列中主要包括变形菌门116 289条，占77.77%；厚壁菌门30 076条，占20.11%；拟杆菌门1 281条，占0.86%。这3种菌门在各标本中均相对含量均较高，但5例标本个体差异显著。对相对含量≥1%的门类进行统计，外伤性细菌性眼内炎患眼标本中相对含量较高的门类有厚壁菌门和变形菌门，分别为83.86%和15.76%，二者在该例标本中的总相对含量达99.62%；白内障术后2 d急性细菌性眼内炎患眼标本中有变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、蓝藻细菌/叶绿体和异常球菌–栖热菌门，相对含量分别为92.32%、2.34%、1.64%、1.68%和1.08%；滤过泡感染性细菌性眼内炎患眼标本中主要为变形菌门，占99.59%；白内障术后22 d迟发性细菌性眼内炎标本中有变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门，相对含量分别为92.39%、3.04%和2.37%；白内障术后1 d急性细菌性眼内炎患眼标本中主要为变形菌门，占99.30%（图2）。
图2 门水平各个样本丰度位于前十位的细菌群类比较 1：外伤性细菌性眼内炎患眼标本 2：白内障术后2 d急性细菌性眼内炎患眼标本 3：滤过泡感染性细菌性眼内炎患眼标本 4：白内障术后22 d迟发性细菌性眼内炎标本 5：白内障术后1 d急性细菌性眼内炎患眼标本
2.2.4 检出细菌的在属水平5例眼内炎标本共检测出120个属，每个标本检测到36~69个属，其中18个属由5个标本共有。对相对含量≥1%的属进行统计，5例标本中相对含量较高的属共检测到19个。外伤性细菌性眼内炎患眼标本中相对含量较高的属有葡萄球菌属、链球菌属、假单胞菌属，分别占65.28%、18.90%和12.76%；白内障术后2 d急性细菌性眼内炎患眼标本中相对含量较高的属有：假单胞菌属（占53.68%）、不动杆菌属（占8.62%）、Limnobacter菌属（占5.96%）、无色杆菌属（占3.69%）、涅瓦菌属（占3.03%）、Methyloversatilis（占2.60%）、水栖菌属（占2.57%）、甲基杆菌属（占1.75%）、柄杆菌属（占1.57%）、Aquabacterium（占1.27%）、寡养单胞菌属（占1.3%）、从毛单胞菌属（占1.24%）、溶杆菌属（占1.23%）、Solimonas（占1.17%）和栖热菌属（占1.13%）；滤过泡感染性细菌性眼内炎患眼标本相对含量较高的属有莫拉菌属和假单胞菌属，分别占88.89%和9.52%；白内障术后22 d迟发性细菌性眼内炎标本中相对含量较高的菌属有假单胞菌属（84.63%），不动杆菌属（1.92%），无色杆菌属（1.91%），鞘氨醇单胞菌属（1.66%），柄杆菌属（1.36%），从毛单胞菌属（1.07%）；白内障术后1 d急性细菌性眼内炎患眼标本中相对含量较高的有假单胞菌属，占97.89%。每个样本中假单胞菌的相对比例均较高，其中白内障术后1 d急性细菌性眼内炎患眼标本中的假单胞菌为绝对优势菌群，占97.89%（图3）。
图3 属水平各个样本丰度位于前十位的细菌群类比较 1：外伤性细菌性眼内炎患眼标本 2：白内障术后2 d急性细菌性眼内炎患眼标本 3：滤过泡感染性细菌性眼内炎患眼标本 4：白内障术后22 d迟发性细菌性眼内炎标本 5：白内障术后1 d急性细菌性眼内炎患眼标本
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讨论
眼内炎的早期诊断至关重要，根据病原学检测结果选择敏感抗生素进行对因治疗是相关领域的研究热点，对前房液和/或玻璃体样本行病原微生物培养是眼内眼诊断的金标准，是目前临床上的常规检测方法，但该方法有如下不足：
（1）细菌培养结果的阳性率为34%～65%，患者围手术期抗生素的应用、采集的标本量不足、标本中含菌量少及微生物自身对生长环境的挑剔等因素均可导致阳性率降低[12-14]。
（2）细菌培养结果阳性时得到的阳性致病菌有时也并非是主要致病菌，培养过程中有些非主要致病的细菌容易生长，有时会导致结果的偏倚。
（3）细胞培养耗时长，一般需要3～5 d，易延误早期治疗时机。
标本涂片也是临床常用的病原学诊断方法，这种方法的优点在于不需要特殊设备，快速简便，但结果的判断主观性强，依赖于技术人员的经验。本研究5例眼内炎标本中仅有2例涂片检测结果阳性，5例标本细菌培养结果均为阴性。我们以往对21例患者的眼内标本涂片结果显示，18例标本中仅有1例见大量阳性球菌，6例房水细菌培养结果阳性，1例玻璃体液标本细菌培养结果阳性[2]。一项多中心研究发现，66例术后眼内炎患者中细菌培养结果阳性者仅占39%，其中假单胞菌属占40%，凝固酶阴性葡萄球菌占32%[4]。本研究中应用16S rDNA高通量测序结果显示，5例细菌性眼内炎房水或玻璃体标本中4例由多种致病菌引起，其中外伤性眼内炎创口较大且伴有眼内异物，病原菌丰富，丰度较高的菌属各自所占比例均在10%以上，葡萄球菌属相对含量最高；青光眼术后滤过泡感染性眼内炎患者上方结膜坏死并渗漏是外来细菌进入眼内的主要途径，标本中相对含量较高的菌属为莫拉菌属和假单胞菌属；3例白内障术后眼内炎由于围手术期应用的抗生素清除了结膜囊的菌群[15]，病原菌较为单一，主要为假单胞菌属。稀疏曲线反映了标本的测序深度，高通量测序技术足以覆盖标本中所有菌群。16S rDNA检测结果与临床判断结果较为一致，此外本研究中发现致病菌丰度与发病时间及感染程度有关，发病时间越长，炎症反应越重，致病菌丰度越高，故16S rDNA高通量测序技术的病原菌检测阳性率高于传统方法。
以PCR为代表的分子生物学检测技术开创了感染性疾病病原微生物检测的新时代，曾有研究者通过PCR扩增细菌核糖体16S rRNA基因序列鉴定泪囊炎病原菌种属，证实该方法准确性高且特异性强[16]，充分说明分子生物学检测技术克服了以往培养检测的缺陷，避免了抗菌药物对病原微生物检测的影响，即便有的病原微生物已被灭活，残留的核酸分子仍可用于致病菌的检测，提高了病原微生物检测的敏感性和特异性。近年来，分子生物学检测技术用于细菌性眼内炎的诊断亦广泛开展，然而传统检测方法通量低，引物设计只针对某一种或某一株致病菌，即便设计细菌通用引物也只能研究高丰度的致病菌[12-14]。细菌性眼内炎致病菌复杂多样，其中低丰度细菌同样扮演着重要角色。本研究结果表明，第二代测序技术的推广克服了传统测序方法通量低、操作复杂等缺陷，实现了对混合致病菌的种属定性，以获得所有致病菌信息。16S rDNA是细菌染色体上编码rRNA的序列，由多个保守区和与之相间的高变区组成，进化较慢的保守区可用于设计同类微生物的通用鉴定引物，进化较快的可变区则可用于设计特异性鉴定引物以此将细菌鉴定到属、种乃至株的水平，已成为细菌鉴定与分类研究中较为理想的靶序列。16S rDNA测序技术作为高通量测序技术依赖的组学技术之一，着眼于对微环境中微生物群落菌种组成进行鉴定分析，提高了细菌性眼内炎病原菌检测的阳性率和准确率。
尽管如此，16S rDNA高通量测序技术仍存在一定的局限性。（1）高通量测序前需进行标本模板DNA的提取，房水或玻璃体液标本中带菌量过少会导致DNA提取率低，无法完成测序。（2）患者经抗感染治疗后灭活的致病菌经PCR扩增仍可能出现阳性结果，影响临床医师的判断。（3）目前的测序方法只能提供致病微生物信息，尚不能对致病菌的耐药基因和敏感性药物进行检测。（4）高通量测序限于较大的测序成本及数据分析平台等因素尚不能得到广泛推广。
目前，高通量测序在临床医学中用途广泛，但在眼科的应用仍很少[17-21]。本研究中将该技术用于细菌性眼内炎的诊断，效率高且准确性好，减少了检验者经验不足、细菌自身生长慢、营养条件苛刻、样本带菌量少等因素的影响，与传统方法互为补充，为细菌性眼内炎的诊断提供了新的选择。
