拉曼光谱实验误差分析方法：实验笔记圆二色光谱

拉曼光谱实验误差分析方法：实验笔记圆二色光谱圆二色谱测定使用日本产JASCO J-810圆二色谱仪，在室温下测定远紫外190-240 nm的光谱。测定样品的浓度为100 μg/ml，样品杯光径0.2 cm。分辨率0.5 nm，带宽0.5 nm ，灵敏度50 mdeg，速度0.8 nm/min。实验方法将纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE检测，将染色并脱色后的胶进行目的蛋白纯度的测定，目的蛋白含量达到95%或以上时（蛋白质纯度越高实验结果越可信）纯化的蛋白可用于圆二色光谱实验。

圆二色光谱 (简称CD)是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。它可以在溶液状态下测定，较接近其生理状态。而且测定方法快速简便，对构象变化灵敏，所以它是目前研究蛋白质二级结构的主要手段之一，并已广泛应用于蛋白质的构象研究中，用于推断非对称分子的构型和构象的一种旋光光谱。

光学活性物质对组成平面偏振光的左旋和右旋圆偏振光的吸收系数 (ε)是不相等的，εL≠εR，即具有圆二色性 。如果以不同波长的平面偏振光的波长λ为横坐标，以吸收系数之差Δε=εL-εR为纵坐标作图，得到的图谱即是圆二色光谱，简称CD。如果某手性化合物在紫外可见区域有吸收，就可以得到具有特征的圆二色光谱。

实验方法

将纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE检测，将染色并脱色后的胶进行目的蛋白纯度的测定，目的蛋白含量达到95%或以上时（蛋白质纯度越高实验结果越可信）纯化的蛋白可用于圆二色光谱实验。

圆二色谱测定使用日本产JASCO J-810圆二色谱仪，在室温下测定远紫外190-240 nm的光谱。测定样品的浓度为100 μg/ml，样品杯光径0.2 cm。分辨率0.5 nm，带宽0.5 nm ，灵敏度50 mdeg，速度0.8 nm/min。

纯化后的蛋白的纯度达到了圆二色光谱所要求的纯度（~96%），我们对其进行了圆二色光谱检测。检测结果如图1。

图1

用杨氏算法（Yang. Jsr）计算多肽的二级结构。杨氏算法是以纯的Helix、Beta、Turn和Random结构的圆二色光谱曲线为基础，将样品测得的曲线数据与四种结构的特征谱线进行拟合，结合样品的摩尔浓度进行计算，可以得到溶液中多肽的各种二级结构的含量及比例。表1显示了38K的CD光谱数据经过杨氏算法分析后的Helix、Beta、Turn和Random的相对比例（Ratio）。

圆二色谱的测定结果表明，该蛋白的二级结构主要由α-螺旋结构（60.3%）和β结构（27.9%）组成含有部分自由卷曲（11.8%），没有turn结构。

表1

注意事项

1、溶剂是一个比较重要的因素，圆二色谱样品中尽量不要用一些会影响圆二色性的离子，其中氯离子影响还是比较大的，所以tris缓冲液是不能用来做CD的。

2、考虑浓度和比色皿的搭配，一般来说比色皿越薄，所需浓度就越大。1cm cell-0.005-0.01 mg/ml，0.1cm cell-0.05-0.2mg/ml