lncrna转录后调控图怎么理解（文献1详解⑤探索lncRNA分子机制）

lncrna转录后调控图怎么理解（文献1详解⑤探索lncRNA分子机制）3恢复性实验表明，恢复AXL 和 c-MET的表达可恢复lncARSR敲除的抗舒尼替尼肾癌癌细胞的表型和下游信号通路（见下图C，D，H，I），而且一起敲除AXL 和 c-MET可有效消除lncARSR介导的抗舒尼替尼特性，而单独敲除没有影响(E，F，J，K)。以上结果表明在高表达lncARSR与AXL 和 c-MET高表达在抗舒尼替尼过程中是同时发生的。作者用抗舒尼替尼细胞外泌体或电击导入lncARSR的外泌体孵育亲本细胞，发现AXL 和 c-MET的表达升高，而沉默lncARSR可消除这一效应（见下图E、F）。2

导语：继作者发现了抗舒尼替尼关键lncARSR，并做了lncARSR的表达调控机制，功能研究，并进一步证明了lncARSR在临床上与舒尼替尼耐药性的相关性，发现其可作为临床指标后，上期作者证实了lncARSR可以被包装进外泌体中，从而在癌细胞间传导舒尼替尼耐药性。然后问题来了，高表达lncARSR可增强肾癌细胞舒尼替尼抗性的分子机制是什么？我们今天一起来探索一番！

lncARSR与RTKs

有证据显示受体酪氨酸激酶（RTKs）在舒尼替尼耐药性产生过程中发挥关键作用。因此作者抑制抗舒尼替尼肾癌细胞lncARSR的表达，WB鉴定多种RTKs的表达变化，发现AXL 和 c-MET的磷酸化水平、蛋白 和mRNA的表达均下降（见下图A、B）。

以上结果表明在高表达lncARSR与AXL 和 c-MET高表达在抗舒尼替尼过程中是同时发生的。

作者用抗舒尼替尼细胞外泌体或电击导入lncARSR的外泌体孵育亲本细胞，发现AXL 和 c-MET的表达升高，而沉默lncARSR可消除这一效应（见下图E、F）。

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恢复性实验表明，恢复AXL 和 c-MET的表达可恢复lncARSR敲除的抗舒尼替尼肾癌癌细胞的表型和下游信号通路（见下图C，D，H，I），而且一起敲除AXL 和 c-MET可有效消除lncARSR介导的抗舒尼替尼特性，而单独敲除没有影响(E，F，J，K)。

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另外抑制AXL 和 c-MET的表达可使lncARSR过表达的亲本细胞恢复对舒尼替尼的敏感性并阻塞相关信号通路（见下图G，H，L）。

综上所述，lncARSR是通过AXL 和 c-MET调节舒尼替尼耐药性的。

lncARSR与miRNA

根据已有报道定位细胞质lncRNA可能具有发挥内源性竞争RNA功能隔绝miRNA，导致与相应miRNA结合的mRNA释放。

为验证这一假设，作者首先敲除Dicer抑制miRNA的产生，而这导致了过表达lncARSR促进AXL 和 c-MET的表达这一效应被消除（见下图A），这说明miRNA在此过程中发挥关键作用。

接着为了证明这一关键作用，作者采用AGO2-RIP实验方法鉴定过表达lncARSR的786-O 细胞中lncARSR与AGO2的结合升高，而与AXL 和 c-MET的mRNA结合降低。同时敲除lncARSR的7Su3rd细胞中AXL 和 c-MET与AGO2的结合升高（见下图A）。

这些结果说明lncARSR与AXL 和 c-MET的mRNA竞争以AGO2为基础的miRNA诱导抑制复合物。

寻找参与其中的miRNA

生物信息学分析显示，lncARSR与AXL 和 c-MET的非编码区域均含有四个miR-34 和miR-449的共用miRNA反应元件（MREs）（见下图B）。而且发现在抗舒尼替尼细胞中存在足够的lncARSR 和 miR-34/449拷贝数（见下图C），这对ceRNA-miRNA相互作用非常重要。

MS2-RIP实验结果显示对比空白对照和突变组，从MS2bs-lncARSR获得的miR-34 /449明显要丰富（见下图B）预示着lncARSR 和 miR-34/449存在特异性的相互作用。

验证miRNA

作者以psi-CHECK2-lncARSRmt(miR-34/449)为阴性对照，psiCHECK2-miR-34 3*为阳性对照，设计荧光报告基因系统，实验结果显示miR-34 或 miR-449 mimics可显著抑制psi-CHECK2-lncARSR（海肾荧光素酶基因3`端非编码区含有lncARSR)的荧光素酶活性而对psi-CHECK2-lncARSRmt(miR-34/449)的无影响(见下图C)，说明miR-34 或 miR-449可主动结合到lncARSR上。

接着作者同样采用荧光报告基因系统，检测lncARSR对miR-34生物传感器的影响，又从反向证明lncARSR可主动与miR-34 或 miR-449（见下图D），这些结果说明lncARSR存在与miR-34 或 miR-449结合的功能性位点。

而且功能验证实验结果显示：采用miR-34海绵抑制miR-34和 miR-449可又有效恢复由敲除LncARSR导致的舒尼替尼抗性的下降（见下图D-F），同时miR-34 mimic可消除lncARSR介导的舒尼替尼抗性（见下图G-I）。

lncARSR与miRNA与RTKs

最后，作者探究lncARSR对miR-34和 miR-449的隔离效应是否会上调AXL 和 c-MET的表达。

荧光报告基因检测结果显示，miR-34海绵可恢复由lncARSR敲除造成的AXL 和 c-MET mRNA表达下调（见下图E），同时miR-34和 miR-449过表达可消除由lncARSR过表达造成的AXL 和 c-MET mRNA表达上升(见下图F)。

这些结果在AXL 和 c-MET mRNA和蛋白水平做了进一步验证（见下图G、H、J、K）。

以上结果说明lncARSR作为miR-34和 miR-449的分子海绵促进AXL 和 c-MET的表达。

来源：永诺生物

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