未来世界的变异生命体：的发光生物体原创
未来世界的变异生命体：的发光生物体原创从洋葱开始的实验不，我没有骗你，之所以看不到，是因为它太微弱了！它的强度一般只有几个到几千个光子／(s·cm2)，典型为100光子/(s·cm2)，弱到10-10瓦以下，光谱从红外到紫外，呈准连续谱。对比一下我们常见的普通太阳光，其强度远远大于1010个光子／(s·cm2)。生物的这种超弱发光，因为实在太暗了，比我们人眼的识别能力低了1000多倍，看不见也就不足为奇了。人类也会发光？事实上，这种“主角光环”并不是以上这些物种所独有的，我们每个人都拥有发光的超能力！纳尼，你在骗我吗？为什么走在路上，看不到任何人身上有光？
我们看电视和漫画时经常会发现这样一个角色，他有着逆天的运气和爆发力，面对再强大的对手也不会输，就算输也是为了以后更强做铺垫，在层出不穷的意外和惊险事故中他总能拥有“不死之身”，究其真相，只有一个——他是主角，拥有“史上最强最逆天”的主角光环！
在生物界，就有那么些个自带光环的生物，水母、乌贼、章鱼甚至小到细菌等都会发光。以萤火虫为例，东南亚的雄萤火虫为了求偶，会群聚在一株树上，同时明灭，看起来像巨型圣诞树。而有些动物幼体，如波多黎湾的各种磷光微细浮游生物发出的蓝白光，夜晚人们凭肉眼也能看得到。这种动物界中的生物发光是最令人惊叹的自然现象之一，特别是对那些漫不经心的观察者来说，看到动物发光是极大的意外惊喜。
他们为什么会发光？
这些生物身上发出的荧光是一种冷发光现象。上面提到的萤火虫，依靠的就是荧光素这样一种小分子有机化合物，它在荧光酶存在的条件下被氧化成处于激发态的氧化荧光素，激发态不稳定，重新回到稳定的基态时，多余的能量就会转化为荧光，并得到氧化荧光素。此时推动小分子进入激发态的是生物氧化，耗费生物能。不同发光生物有不同的荧光素和荧光素酶。在生物体外，要想模拟这种机制，可以让荧光分子经某种波长的光照射，吸收光的能量后进入激发态，此时，没有入射光，就不会有荧光。
人类也会发光？
事实上，这种“主角光环”并不是以上这些物种所独有的，我们每个人都拥有发光的超能力！
纳尼，你在骗我吗？为什么走在路上，看不到任何人身上有光？
不，我没有骗你，之所以看不到，是因为它太微弱了！它的强度一般只有几个到几千个光子／(s·cm2)，典型为100光子/(s·cm2)，弱到10-10瓦以下，光谱从红外到紫外，呈准连续谱。对比一下我们常见的普通太阳光，其强度远远大于1010个光子／(s·cm2)。生物的这种超弱发光，因为实在太暗了，比我们人眼的识别能力低了1000多倍，看不见也就不足为奇了。
从洋葱开始的实验
第一次让人们了解到生物超弱发光的实验，可以追溯到1923年前苏联科学家Gurwitsch等人完成的孳生辐射实验。实验发现，迅速分裂的细胞产生紫外辐射，促进邻近另一洋葱鳞茎根尖的细胞分裂。
实验时，将一个洋葱的根尖对着另一洋葱的分生组织，两条洋葱的根各自放进两条毛细管中。垂直的根再在外面再套上一个金属套，但是裸露了一段，既没有金属，也没有玻璃管。实验发现，这段裸露的部分分裂得特别快，已经长出了一个小包，其他部位则生长缓慢。是什么导致了这样的结果呢？因为裸露的部位可以改变，于是排除了垂直洋葱自身的原因。那影响因素就只能是放在它旁边的另一个洋葱了。当时称这种辐射为“有丝发生”辐射。是不是有种隔空喊话的既视感？
像这样的一个生物体产生物质影响了同类的，并不少见。生活中，将成熟的香蕉和半生的放在一起，用以加速香蕉的成熟，是因为成熟的香蕉可以产生乙烯这种气体，而这种气体是促进果实成熟的植物激素。关于生物微弱发光作用的研究，已经有研究表明，它在神经系统中起到信号传递作用，是化学信号、电信号之外的第三种信息传递方式。
孳生辐射实验
但在那时候，生物超弱发光的强度极低，由于技术的限制，没有足够灵敏的设备可以直接检测到这种发光，在相当长的时间内研究的进展不大。
技术改变生活，到了20世纪50年代，光电倍增管的出现，使检测微弱光信号成为可能，重又唤起了生物超弱发光研究的“生机”。1954年，意大利学者L.Colli等人将小麦、菜豆、小扁豆、玉米等萌发的种子作为实验样品，放在自己装备的有光电倍增管的验证仪器上，首次证实了生物超弱发光现象的存在。70年代以来，西德以Popp为首的研究小组从实验和理论两方面对生物超弱发光现象进行了系统研究，只要是活人、活的动物，甚至是活的组织、活的器官、活的细胞，每时每刻都在连续不停地向外界发光，由此认为这是自然界普遍存在的、生物体固有的一种功能。
深度“扫描”人体检测自发光
但是光凭这些检测，怎么能满足我们视觉动物的需求呢？仪器检测到了光子，我又看不见。于是超高灵敏度的弱光图像探测成为了需求。2009年日本团队便运用他们改进的成像设备，向我们展示了人体在不同时间自发光的图像。他们的结果显示，面部发光强于躯体，面部中间又强于外周，一天之内下午16：00最强。
人体不同部位体表弱发光有很大差异，光照对弱发光有影响，避光后的衰减速度也不一样，体表的弱发光强度随体温、人体昼夜节律而变化。近年来，血液弱发光作为一种疾病检测手段，也开始渐渐受到重视。有研究表明，血液的弱发光与供血者的年龄、性别有关，癌症患者的血液弱发光强度高于正常人。
人体生物超弱发光检测。C-G为不同时间
生物如何发光？
关于生物超弱发光机制的理论研究很多，可初步分为物理方面和化学方面两大类。化学方面主要有代谢发光机制，物理方面则以相干辐射机制为主。
“代谢发光”生物超弱发光主要来源于氧化还原等代谢反应，如脂肪酸氧化、花生四烯酸氧化。其中脂类自由基的作用尤为重要。一些自由基复合反应时释放的能量高达480KJ/mol，足以产生大约230nm的紫外光子，近似于有丝分裂辐射光子的波长。同时，由于活体内氧化反应速率受抑制剂的控制，生物在代谢过程中生产的大量自由基不可能使发光强度太高。
相干辐射认为，生物系统内存在一个高度相干的电磁场，很可能是活组织内通讯联络的基础。生物光子与激光特性类似，产生激光需要激活物质、泵浦源和谐振腔，生物系统的激活物质可以是生物能——三磷酸腺苷（ATP），使之实现粒子反转的泵浦源能量则来自糖酵解，生物体的谐振腔是DNA，以此很好地解释了生物分裂时的超弱发光。
“后天补足”的荧光
哎，虽然证明了我们可以发光，但是太弱，肉眼根本看不见，一点都不酷炫，不能哔哩哔哩亮闪闪。但是，不要急，我们是人类，我们有智慧！办法总会有的，先天不足，我们后天来补！
爱美之心人皆有之，在镭被发现后，就有不少女工将这种闪闪发光的物质涂在头发和指甲上，让自己看起来更漂亮。虽然这在现在看来是作死的节奏，但是也反映了人们的审美情趣和美好愿望。
一个会发光的人，想想都有点小激动呢。
于是，我们敬爱的科学家们登场了，不过他们的兴趣可不只是为了美观。如果把我们的身体比做一个庞大的工厂，这个工厂复杂得很，有很多部门，有工人，也会有小偷，有时候还会出现问题。可是工厂的部门都是一样的装修，工人都穿着一样颜色的衣服，如果让你去了解这个工厂的运作模式，每个部门在生产什么，每个工人的作用是什么？要怎么下手呢？你甚至都找不到这个部门、这个人在哪。所以，20世纪初，科学家们利用组织及细胞自发荧光来观察研究原生动物。会发光的细胞，就像工厂里穿着不一样颜色衣服的工人，他与其他工人的区别越大，你就越容易发现他。
但是天然荧光生物分子种类有限，强度较弱，而且大多数分子是不发光的。于是，科学家们研究出了荧光探针技术，可以选择性地将分析对象的信息连续转变为易测量的荧光信号。荧光探针技术的策略是给那些原本不发光的生物分子标记上荧光分子，使得他们在周围组织和细胞中像黑暗中的星星那样闪闪发光，以便轻易被人们的视线捕捉到。
荧光成像相当于“点亮”感兴趣的部分。怎么在粉色衣服中找到戴小红花的人呢？如果他们都穿着黑色衣服，要找的是黄色的花呢？是不是就很容易了？在显微镜下，大家都一样的话，就很难找到目标，如果感兴趣的是物体会发光，其他都是暗淡的，是不是就容易了呢？
如何标记呢？荧光探针分子通常由识别基团、荧光基团、连接体部分组成。识别基团决定探针分子的选择性和特异性，负责找到到感兴趣的基团，连接体连接识别基团和荧光基团，一旦识别基团找到了感兴趣的分子，荧光基团也被一起“绑”在上面了。通过荧光基团吸收能量，发出荧光，被标记的分子就被“点亮”了。
借助现代的荧光显微镜和影像增强术，人们就可以清楚地观察到感兴趣的区域，无论是细胞的精细结构，还是观察、测量用荧光标记的有机体和分子，都不在话下。
“人造”荧光从何而来？
故事要从我们的“衣食住行”中的“衣”讲起。人类在发明纺织的同时，也发展了染色技术，其历史可追溯到史前的远古时代。刚开始的时候，人们都是运用天然染料，植物的花、叶、树皮，矿物中的朱砂、雄黄等。直至19世纪有英国人发现冒肤能将丝织品染成紫红色，开创了化学合成染料的工业纪元。看似无关的领域，科学家们可是触类旁通，既然染料可以染纺织品，为什么不能用来染生物体呢？20世纪30年代起，这些有机小分子染料开始被用于活体细胞和组织的荧光显微成像染色。
有机小分子具有强大的可塑性和应用潜力，通过对其结构进行巧妙设计和改造，就能够设计合成出满足各种需要的荧光探针。当下，已经有细胞活性探针、膜荧光探针、细胞器探针、电位敏感探针、活性氧探针等功能各异的探针。改造分子，这可是化学家们的强项，他们发挥专业优势，变着花样地做出了各种结构的分子，满足不同的需求。识别基团可以有更好的特异性，荧光基团可以发出更亮、颜色更多的光。
有机小分子荧光探针的几种机制
以常用的锌离子荧光探针为例，识别基团是邻氨基苯硫醚，可以和锌离子结合，荧光基团是香豆素，两者以席夫碱相连，席夫碱抑制了香豆素的发光。但是当有锌离子存在时，锌离子可以与识别基团上的硫原子、连接体上的氮原子和荧光基团上的氧原子配位，整个荧光探针分子构象变化，香豆素回到了可以发光的构象，让荧光从无到有。
下面这些花花绿绿的图片可不是“绣花枕头”，它显示了目前可以被标记的各种细胞结构。这些标记不仅可以根据有没有荧光定性，还可以根据荧光的强弱定量。由于对生物的毒副作用小，更可以在活体中观察，让观察者可以直观地看到在细胞内实时发生的生理过程，简直就像在看电影。
随着荧光探针技术的不断发展和完善，推动了目前较热的基因组学、蛋白质组学、生物芯片以及药物作用机制等领域的研究。
荧光蛋白的诞生
虽然有机小分子可塑性良好，但是一些有机小分子荧光探针的非水溶性及毒副作用、光漂白性等，使其在生命科学、医学等领域中的应用受到了限制。
1955年，有人发现水母可以发绿光，但不知其原因。1962年，日裔美国科学家下村修（Osamu Shimomura）和美国科学家约翰森（Frank H. Johnson）从水母中分离生物发光蛋白——水母素时，意外地发现了一个副产物——绿色荧光蛋白（GFP），它在阳光下呈绿色。1974年，他们提取到了这种蛋白质。
水母素是荧光酶的一种，它需要荧光素才能发光，与萤火虫的发光原理相同。而GFP是蛋白质本身发光，在原理上有重大突破。你们看，你们看，人家蛋白质自己发光就可以很亮，前面的生物超弱发光相干辐射机制认为，超弱发光依靠的是DNA，此时的DNA就像一把小小的激光枪，但是它的光弱得看不见。虽然蛋白质在谁是遗传物质之争上输给了DNA，但是人家在发光上扳回了一局。所以说，是金子总会发光的。
GFP发光原理
GFP的发光过程需要发光蛋白Aequorin的帮助。水母体内的Aequorin与钙离子结合会发出蓝光，蓝光会立刻被一种蛋白吸收，发出绿色荧光。
绿色荧光蛋白的发现使得荧光蛋白的研究飞速发展，科学家们开始制造各种不同的荧光蛋白。20世纪80年代，美国科学家普鲁切（Douglas Prasher）成功地克隆出了水母中编码绿色荧光蛋白的基因，使得荧光蛋白标记的大量应用成为可能。1994年美国科学家沙尔菲（Martin Chalfie）利用PCR技术扩增了GFP的编码区，成功地将它克隆到大肠杆菌和线虫细胞中，通过紫外线或蓝光激发，均产生了很美妙的绿色荧光。沙尔菲的这项研究首次证实了GFP作为发光标记物用于生物学研究的价值，这才是GFP作为荧光指示剂的真正突破。
由于荧光蛋白的“发光”基本不需要外来物质“刺激”，并且荧光蛋白具有极佳的稳定性，对生命体也无毒害，因此，荧光蛋白可以在各种有机生命体内“点亮”科研人员想要的研究的分子或者基因。
尽管野生型GFP能发出很绚丽的荧光，但它还是有不少缺点，比如有两个激发峰、光稳定性不好、在37℃不能正确折叠等。这回是生物学家们发挥特长的时候了。1994年，美籍华裔科学家钱永健首次完成对GFP发光基团周围残基的重大改造，得到了多种改良型的GFP。改良过的GFP增强了其光谱性质、荧光强度和光稳定性，折叠能力也得到改善，颜色也从原来的绿色荧光蛋白到现在的蓝色、蓝绿色、黄色荧光蛋白。基于以上研究，下村修、沙尔菲和钱永健获得了2008年的诺贝尔化学奖，荧光蛋白的研究也被称为“点亮”科学。
值得八卦一下的是，普鲁切并没有得到诺奖，作为发现GFP基因并把它免费馈赠给这些诺贝尔获奖者的科学家，普鲁切最终却因为找不到一份科学领域的工作，成了一位开巴士的司机，令人扼腕叹息。
来自钱永健实验室的荧光细菌画
永远在路上的荧光技术
从开始的荧光大肠杆菌到现在的荧光兔子，荧光蛋白已经实现了跨越式的发展。在科学界，荧光蛋白被称为生物化学的“北斗星”。通过常规的基因操纵手段，用荧光蛋白来标记目标蛋白，可以跟踪和判断生物细胞的实时分子变化，了解以前看不到的生物过程，例如细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和信号转导，肿瘤细胞的转移等过程。因为色彩鲜艳，荧光蛋白甚至被应用到商业领域，2003年美国约克镇的家庭宠物荧光鱼就是其商业应用的首个案例。
但是在脑科学研究领域，要想把数量庞大、错综复杂的神经细胞彼此区分开，还需要更新的技术。2007年，哈佛大学的神经生物学家杰夫•W•里奇曼（Jeff W. Lichtman）和他的团队研发了一项名叫“脑彩虹”（Brainbow）的技术，他们利用荧光蛋白能让小鼠的神经细胞同时显示出几十种不同的色彩。这种技术最大的作用是将某些需要研究的细胞与错综复杂的背景区分开来。通过对不同色彩的分析，可以计数细胞，也可以追踪细胞的走向，观察神经网络的连接布局以及细胞之间的相互作用。
好比要拍出好看的照片，不仅要会化妆，相机本身也很重要。无论是对有机小分子荧光探针的研究，还是对荧光蛋白的改进，都好像是把拍照的人变美了。所谓好马配好鞍，检测荧光信号的荧光显微镜的研究怎么能落后呢？物理学家们又开始改造荧光显微镜，什么双光子激发、光子随机重构、光激活和光转换荧光蛋白、振镜扫描、高速摄像机等等等等，都是从成像原理上进行改进，有效地提高了显微镜的时间空间分辨率和观察深度。
科学与技术总是相辅相成。如前面描述，没有光电倍增管的出现，生物超弱发光也许至今还是一个无人问津的领域。而关于生物超弱发光的研究如今离应用还很远，主要还是由于它对检测仪器的要求过高。再看荧光蛋白和荧光显微镜的结合，则完全是“你负责貌美如花，我负责赚钱养家”的和谐画面。
最后，让我们来欣赏一些闪闪发光的神经元吧。他们在被“点亮”之前，没有人知道他们在哪里，长什么样，又在做些什么，整个大脑就像一片未知的混沌。如今，得益于荧光蛋白，大脑也开始揭开它神秘的面纱。
作者杨利华，系中科院上海生科院神经科学研究所
