crispr cas9识别位点，关闭意外可变剪切

crispr cas9识别位点，关闭意外可变剪切为了进一步探索外显子跳过可能产生转录本的想法 科学家们使用CRISPR介导的Ctnnb1外显子3的编辑，可能会导致外显子跳过并导致功能增强表型。 Ctnnb1的外显子3编码促进β-catenin转录因子降解的磷酸受体残基; Ctnnb1外显子3的基因切除与外显子4相结合 - 稳定了积累在细胞核中的活性β-联蛋白。设计了11个靶向Ctnnb1外显子3（Ctnnb1-sg1至-sg11）区域的sgRNA，将个体sgRNA转导到KP细胞中，并利用高通量测序分析了每条线上sgRNA靶位点的编辑程度。三种sgRNA（sg6，sg9和sg10）低效靶向Ctnnb1。然而，八种Ctnnb1 sgRNA（sg1至sg5，sg7，sg8和sg11）在其目标位点诱导了超过20％的频率的indels。例如，Ctnnb1-sg1在大约65％的读数中产生 T插入。在由强Ctnnb1 sgRNA靶向的每个群体中，检

CRISPR广泛用于通过诱导小的插入和缺失来破坏基因功能。华人科学家Wen Xue和著名生物信息学家 Zhiping Weng在Genome Biology 发表题为：“CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by alternative splicing or exon deletion ”，发现一些guide RNA（sgRNA）可以诱导外显子跳跃或造成删除外显子的大型基因组缺失。例如，CRISPR编辑β-catenin外显子3，诱导了外显子的部分跳跃和β-catenin的核积累。单个sgRNA可以诱导小的插入或缺失，其部分改变剪接或意外的较大缺失，从而去除外显子，外显子跳跃增加了在CRISPR实验中必须考虑的可能的结果，也许可以利用它们。

科学家们最近使用CRISPR在两个独立的肺腺癌细胞系中破坏了Kras癌基因，分离了两个单细胞克隆，每个克隆在外显子2中携带移码缺失：KP1在G12D等位基因中携带2-nt“-CG”缺失，1-nt“-C “在野生型（WT）Kras等位基因中的缺失;而KP2携带2-nt“-GG”缺失。两个克隆都不产生全长Kras蛋白，表明所有三个缺失破坏了Kras阅读框。

早期外显子中的Frameshift突变引发无义介导的衰变（NMD），其消除具有提前终止密码子的mRNA。

然而，当分析mRNA测序（RNA-seq）数据时，我们发现与亲代KP细胞相比，KP1细胞中Kras mRNA水平仅降低19％，KP2细胞中仅47％。两个克隆产生的外显子2读数较少，但正常水平的外显子1和3读数，表明外显子2可能会跳过KP1和KP2克隆。实际上，检测到外显子1-3连接读数，表明外显子2被跳过。计算外显子2读数和总读数之间的比例，发现外显子2仅包含在KP1克隆的Kras读数的64.0±9.1％中。

在KP2克隆中观察到类似的外显子2跳跃Kras mRNA的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）产生两个产物：一个对应于完整的Kras互补DNA（cDNA），另一个对应于外显子1-3同种型。外显子1-3同种型保留了可以启动从外显子3（附加文件1：图S2）中的ATG密码子翻译的部分Kras开放阅读框，并产生严重截短的KRas蛋白。

KRAS的编辑并没有诱导全基因组的剪接。在KP1细胞中鉴定到97个可变剪接的外显子和KP2细胞中的177个。 KP1和KP2克隆共有22个包含或排除，除了Kras外显子2是两个克隆中最大的变化。因此，编辑Kras外显子2特异性地引起Kras外显子2的跳过。值得注意的是，小鼠KrasG12D（GGU至GAU）转录物不跳过exon2.

为了进一步探索外显子跳过可能产生转录本的想法 科学家们使用CRISPR介导的Ctnnb1外显子3的编辑，可能会导致外显子跳过并导致功能增强表型。 Ctnnb1的外显子3编码促进β-catenin转录因子降解的磷酸受体残基; Ctnnb1外显子3的基因切除与外显子4相结合 - 稳定了积累在细胞核中的活性β-联蛋白。设计了11个靶向Ctnnb1外显子3（Ctnnb1-sg1至-sg11）区域的sgRNA，将个体sgRNA转导到KP细胞中，并利用高通量测序分析了每条线上sgRNA靶位点的编辑程度。三种sgRNA（sg6，sg9和sg10）低效靶向Ctnnb1。然而，八种Ctnnb1 sgRNA（sg1至sg5，sg7，sg8和sg11）在其目标位点诱导了超过20％的频率的indels。例如，Ctnnb1-sg1在大约65％的读数中产生 T插入。在由强Ctnnb1 sgRNA靶向的每个群体中，检测到三个跨越外显子2至5的RT-PCR产物。对应于包含外显子3的正常拼接的转录本。其他两个产物对应于可选剪接的转录物：一个跳过外显子3，另一个跳过外显子3和4 。

靶向DNA链的Ctnnb1 sgRNAs引发外显子跳跃和Cas9核酸酶活性对于外显子跳跃是必需的。 Western印迹分析显示，用强sgRNA转导的细胞群体产生较小的约74kDβ-联蛋白，其大小与外显子2-4剪接产物预期的相符（图2g）。全长β-连环蛋白在转导后4天未显着消耗。为了检验选择性剪接是否依赖于慢病毒载体中Cas9或sgRNA的连续表达，我们共同转染Cas9和Ctnnb1-sg1或非靶向sgRNA对照。转染后7天，当转染Cas9和引导RNA时，应用免疫荧光法检测β-联蛋白定位。在用非靶向对照sgRNA转染的小鼠成纤维细胞中，局限于细胞连接的β-连环蛋白（附加文件1：图S5a）。相比之下，在许多用Ctnnb1-sg1转染的细胞中，检测到核中的β-连环蛋白。这些结果表明，外显子跳跃不需要连续编辑，并且由CRISPR介导的Ctnnb1外显子3编辑引起的外显子3跳跃产生功能增强的β-联蛋白亚型。