金黄色葡萄球菌感染的临床分析：金黄色葡萄球菌的API-STAPH生化鉴定及核糖体分型分析
金黄色葡萄球菌感染的临床分析：金黄色葡萄球菌的API-STAPH生化鉴定及核糖体分型分析在我们的研究中，获得的2011年的金黄色葡萄球菌菌株最初是通过传统方法鉴定的，并通过API-STAPH鉴定试验，16S rRNA测序和核糖分型分析进一步鉴定和分型。 数据表明葡萄球菌分型的分子分析比传统的生物化学方法更可靠，并且核糖分型可能在鉴定金黄色葡萄球菌亚型中起重要作用。本研究旨在找到一种快速可靠的方法来鉴定金黄色葡萄球菌亚型，并通过RiboPrinterTM微生物表征系统（DuPont Qualicon，Wilmington，Delaware，USA）建立葡萄球菌数据库。通过分子杂交设计的核糖体系被广泛用于细菌识别和打字。 RiboPrinter中使用的探针大约为6.5kb，覆盖了细菌基因组中的所有5S，16S和23S区域，并且可以为分析和监测提供更可靠的数据。图|视觉中国传统上使用典型的培养基和生化检查检测食物中的金黄色葡萄球菌。根据中国食品微生物检验食品安全国家标准 - 金黄色
金黄色葡萄球菌是食品和饮料中最普遍的致病菌之一。传统的金黄色葡萄球菌鉴定方法是基于生化试验，可能导致结果不明确。
在本文中，API-STAPH测试，16S rRNA测序和核糖体分型分析用于金黄色葡萄球菌的鉴定和分型。 数据表明，16S rRNA测序鉴定的准确性（≥99％）高于API（93％）。Ribotyping将46个菌株分为22 Ribogroups。 16S rRNA测序和核糖体分析对细菌鉴定更可靠，核糖分析分析可能在金黄色葡萄球菌亚型鉴定中起重要作用。
金黄色葡萄球菌是兼性厌氧革兰氏阳性球菌; 它是非运动的，过氧化氢酶和凝固酶阳性。 葡萄球菌细胞是球形的单个或成对的球菌，或形成葡萄样的簇。它们能够在很宽的温度范围内生长（7至48.5°C，最适温度30至37°C;），pH值（4.2至9.3 ），最佳浓度为7〜7.5;氯化钠浓度（高达15％NaCl），这些特征使金黄色葡萄球菌成为食品和饮料中最常见的致病菌之一，葡萄球菌的毒性是由肠毒素（SE） 而相关的食源性疾病通常表现为恶心，呕吐，腹痛和腹泻。
在诊断中，金黄色葡萄球菌是可导致皮肤和组织感染，肺炎，败血症和器官相关感染的主要人类病原体。耐甲氧西林和其他抗菌剂的菌株的出现已成为主要关注的问题，因为由全身耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染引起的死亡率更高。
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传统上使用典型的培养基和生化检查检测食物中的金黄色葡萄球菌。根据中国食品微生物检验食品安全国家标准 - 金黄色葡萄球菌（GB4789.10-2010），将细菌样品在7.5％氯化钠培养基中培养，或直接在Baird-Parker琼脂培养基上进行计数，然后用凝固酶检测可疑菌落。凝固酶阳性候选物被确定为金黄色葡萄球菌。尽管上述传统方法已经使用了多年，但其耗时且更重要的是仍可能导致模糊的识别。
基于聚合酶链式反应（PCR）的分子技术也已用于葡萄球菌鉴定多年。这些方法通常用于扩增在细菌基因组中高度特异的保守基因目标。迄今为止，已有数个分子靶标被利用鉴定葡萄球菌物种，如16S rRNA基因，tRNA基因间隔区，热休克蛋白60（HSP60）基因和femA基因。研究人员还报道了基于脉冲场凝胶电泳和多位点序列分型的葡萄球菌物种鉴定。然而，葡萄球菌亚型的系统数据库尚未广泛公布。
本研究旨在找到一种快速可靠的方法来鉴定金黄色葡萄球菌亚型，并通过RiboPrinterTM微生物表征系统（DuPont Qualicon，Wilmington，Delaware，USA）建立葡萄球菌数据库。通过分子杂交设计的核糖体系被广泛用于细菌识别和打字。 RiboPrinter中使用的探针大约为6.5kb，覆盖了细菌基因组中的所有5S，16S和23S区域，并且可以为分析和监测提供更可靠的数据。
在我们的研究中，获得的2011年的金黄色葡萄球菌菌株最初是通过传统方法鉴定的，并通过API-STAPH鉴定试验，16S rRNA测序和核糖分型分析进一步鉴定和分型。 数据表明葡萄球菌分型的分子分析比传统的生物化学方法更可靠，并且核糖分型可能在鉴定金黄色葡萄球菌亚型中起重要作用。
图|视觉中国
1.材料和方法
1.1.株
2011年中国病原菌调查共收集到46株金黄色葡萄球菌，样品包括沙拉，冷冻甜点，冷盘，海鲜和猪肝。 原始鉴定方法遵循中国食品微生物检验食品安全国家标准 - 金黄色葡萄球菌（GB4789.10-2010），革兰阳性球菌和凝固酶阳性球菌均被判定为金黄色葡萄球菌。 在我们的实验室中，所有分离物均储存在-70℃。
1.2. API-STAPH识别测试
回收金黄色葡萄球菌分离株并在37℃培养至少48小时。 按照使用说明书中所述的推荐程序，使用API-STAPH IDENT条（bioMérieux，Marcy l'Etoile，法国）进行API-STAPH鉴定试验。
1.3. 16S rRNA测序
金黄色葡萄球菌分离株的基因组DNA通过细菌基因组DNA提取试剂盒（Tiangen Biotech，Beijing）提取。 使用Takara○RR Taq TM试剂盒（Takara Biotechnology，Dalian）分别扩增16S rRNA。 特异性PCR引物是5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。 PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳，预期产物约1.5kb。 通过Invitrogen（生物技术有限公司，上海）测序扩增的DNA，并使用BLAST工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）与National Center for Biotechnology Information公共数据库 /）物种分配。 Clustal X 1.83和treev 32软件用于系统发生。
1.4.自动核糖分型
金黄色葡萄球菌分离物经过自动化处理
通过RiboPrinter微生物表征系统进行核糖分型。 在胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂（TSA）平板上获得纯培养物样品，在37℃下温育24小时，随后在生产者的指示下进行分析。
EcoRI是用于核糖体分析的限制酶。 使用Ribo explorer软件分析结果，如果它们的模式之间的相似系数≥0.93，则判定该菌株具有相同的模式。 BioNumerics软件（版本6.6; AppliedMaths，Sint-Martens-Latem，比利时）分析了46种分离物获得的RiboPrinter®图谱。 使用具有0.5％优化的Pearson相关系数计算配对相似性，并且从得到的相似性矩阵中导出UPGMA（使用算术平均的未称量的配对组方法）树状图。
2.结果
2.1. API-STAPH标识配置文件
按照用户手册中的标准方案对46个金黄色葡萄球菌候选者进行API-STAPH测试。 结果如图1所示，其中43株分离株鉴定为金黄色葡萄球菌，主要生化特征如下：0（阴性对照），XLT（木糖醇），MEL（D-蜜二糖），RAF（D-棉子糖） ，XYL（D-木糖），MDG（甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷）呈阴性反应; GLU（葡糖胺），FRU（D-果糖），MNE（D-甘露糖），MAL（D-麦芽糖），LAC（D-乳糖），TRE（D-海藻糖），MAN（D-甘露糖醇），NIT 硝酸盐），PAL（β-萘基磷酸酯），VP（丙酮酸钠），SAC（D-蔗糖），NAG（N-乙酰氨基葡萄糖），ADH（L-精氨酸）和URE（尿素）为阳性反应。 然而，分离物＃29被报道为木糖葡萄球菌，其中XLT（木糖醇）和MEL（D-蜜二糖）为阳性; 报道了＃39和＃42分离物为葡萄球菌属（Staphylococcus warneri），其中LAC（D-乳糖）和NAG（N-乙酰葡糖胺）为阴性。
2.2. 16S rRNA测序
基于NCBI数据库爆炸后的16S rRNA测序，46株分离株均为金黄色葡萄球菌，相似性≥99％。 虽然结果与API-STAPH试验不一致，但16S rRNA测序在基因水平上检查和鉴定，并且与API-STAPH试验相比可能更可靠。 所有分离株的PCR产物均为1.5kb左右，全部采用clustal X 1.83和treev 32软件进行分型，结果表明这46株菌分为两个群，其中A群包括12株（＃ 3，＃12，＃13，＃22，＃23，＃24，＃26，＃31，＃34，＃40，＃44，＃46）和簇包括其余34个分离物（图未示） 簇A和B之间的唯一区别是序列中的第978个碱基对，其中簇A是“C”并且簇B是“T”。
2.3.核糖核苷酸分析
为了进一步检查这些菌株，并建立葡萄球菌亚型数据库，在通过杜邦数据库比较带的位置，重量和强度后，所有46种分离株均由RiboPrinter®鉴定和分型。 采用BioNumerics软件对结果进行收集和分析，结果如图2所示。被测菌株分为两大类，A类群38株（83％），B群包括8株（17％）。 具有相同模式的菌株属于相同的ribogroup，并获得22个不同的ribogroups。 最大的金黄色葡萄球菌菌株是ECORI 521-19-S-5（17株），占37％; 其次ECOR1521-35-S-4（4株）和ECORI 521-64-S-7（3株）分别占9％和6％; 第三次是ECORI 521-20-S-6，ECORI 521-65-S-2和ECORI 521-62-S-3分别占4％; 其余16个ribogroups（35％）每个只有一个菌株。
3.讨论
传统的金黄色葡萄球菌的鉴定取决于选择性培养基上的典型形态学和特异性凝固酶反应，凝固酶阳性和革兰氏阳性球菌可用于鉴定金黄色葡萄球菌。然而，其他凝固酶阳性菌不是金黄色葡萄球菌，因此在常规金黄色葡萄球菌鉴定中可能存在模糊判断的问题。 API-STAPH鉴定试验的优点如下：商业上可获得的API-STAPH试验在一个试条上组装了20个生化反应，并且是一种缩短试验周期的改进方法;很容易接种;该数据库包括20个葡萄球菌属。不需要特殊设备。然而，它的颜色反应很难解释，配置文件寄存器包含了更多确定性的鉴定测试，而没有补充测试的API IDENT的鉴定能力很低，因为许多生成的配方数对于单个物种并不是唯一的。在这项研究中，43株分离株完全被鉴定为金黄色葡萄球菌，但是，三株分离株对S.warneri和S. xylene具有不明确的报道，因为葡萄球菌种之间的特定生化反应几乎相同。为了快速鉴定金黄色葡萄球菌并建立葡萄球菌亚型数据库，我们首先使用16S rRNA测序检查了46个分离株，结果表明分子水平的细菌鉴定更可靠，准确性≥99％;然而，打字时也存在问题，因为只有两个簇可以通过16S rRNA测序分开，这可能不太敏感，因为引物27F和1492R只能覆盖部分16S rRNA区域。用于自动核糖分型分析的探针可覆盖更大的核糖体RNA区域，并提供更严格的报告。图1显示22个不同的ribogroups从46个分离物中分离出来，这表明不同的ribogroups可能有特定的序列，可能来自不同的资源和分布。
目前，当局许多认为PFGE是所有其他技术相比较的金标准。事实上，PFGE被用作国家食源性感染流行病学调查系统的参考分型工具。但是，这种方法费时费力，需要相当的技术技能，少数菌株难以打印。 RiboPrinter®系统实现了自动化和标准限制性片段长度多态性（RFLP）分析，并针对细菌基因组的rRNA编码区。限制性内切酶，如EcoRI或PvuII，将细菌DNA切成片段，加工后形成特征性条带或“指纹”。该系统捕获条带图案的图像并将其数字化为RiboPrint图案。RiboPrinter®系统技术还研究了比其他细菌鉴定系统更大部分的细菌基因组。 RiboPrinter®系统不是仅仅分析编码16S rRNA序列的区域，而是调查编码5S，16S和23S序列的区域，以及任何一侧的间隔区和叶绿素基因。这种丰富的信息深度允许在相同物种的菌株之间进行高度精确的区分，即使是具有相同16S序列的菌株也是如此。它也适用于细菌菌株的快速和高通量分型，总动手处理时间约为每个分离株12分钟，每天可从新鲜菌落直接输入多达32个菌株。此外，该系统的广泛数据库允许实验室比较凝胶中和凝胶之间存储的条带模式，并鉴定相关分离株的核糖体簇。这种方法的局限性在于：购买成本非常昂贵且运行成本高，分类基于来自细菌rRNA区域的有限数量的片段。在亚种水平上表征是可能的，但有时不在菌株水平。
总之，有必要建立细菌鉴定和分型的分子方法，自动化核糖分型分析可能在未来有更广泛的应用。
1. 钟玮 冯震 鲍英 等. 金黄色葡萄球菌的API-STAPH生化鉴定及核糖体分型分析[J]. 中国抗生素杂志 2013 38(5):354-359.
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