确定基因的检测方法有pcr和什么？如何为农作物品种

确定基因的检测方法有pcr和什么？如何为农作物品种“在植物基因组中存在一些特定的区间片段——SSR序列，它们在同一物种中普遍存在，但在不同品种中却高度特异，且不复杂、易鉴定，是区分不同品种的关键位点。这些位点的组合排列就相当于品种的DNA‘指纹’。”从事了20多年SSR分子标记研究的北京市农林科学院玉米研究所主任赵久然回忆，SSR—DNA指纹技术在我国种业领域初露锋芒，是在玉米育种领域。不同品种具有的特异性DNA片段组合构成了作物独一无二的“指纹”，用以“验明正身”的前提是建立准确、完整、共享的“指纹库”但一直以来，DNA指纹数据库标准样品来源和构建标准不统一等问题，制约着指纹检测技术在种业领域内的应用效能。今年4月，由农业农村部主办、全国农技中心承办的全国农作物品种DNA指纹库公共平台（简称“DNA指纹库平台”）正式上线运行，实现了“农作物DNA指纹档案”的线上共用共享，解决了品种真实性鉴定中标准样品取样难、耗时长，侵权案件审判时效性差

今年4月，由农业农村部主办、全国农技中心承办的全国农作物品种DNA指纹库公共平台（简称DNA指纹库平台）正式上线运行，实现了“农作物DNA指纹档案”的线上共用共享，解决了品种真实性鉴定中标准样品取样难、耗时长，侵权案件审判时效性差等问题，也为避免同质化育种提供了“参考数据库”。

人类指纹因其外观纹理具有高度特异性，常被用作个体标记。其实，动植物也有自己独一无二的“指纹”，就潜藏于巨量冗杂的DNA片段中——DNA指纹。

DNA指纹鉴定在法医学鉴定、医学诊断等领域的广泛应用，已为人所熟知。其实，在农作物品种鉴定领域，DNA指纹检测同样可以大显身手。

“应用SSR（简单重复序列）技术检测一个样品，只需要20—40粒种子，一个实验员3个工作日就可以完成。”农业农村部农作物种子质量监督检验测试中心（深圳）副主任刘晋介绍，按农作物品种鉴定的传统做法——田间小区种植鉴定，得选一大片地种植，至少要在一个作物生长周期持续观察测定，比如水稻，需要100—120天，“有时等鉴定结果出来，下个播种季已经错过了。”更关键的是，DNA指纹检测受人为因素影响极小，品种间1个碱基位点差异都能检测出来。

但一直以来，DNA指纹数据库标准样品来源和构建标准不统一等问题，制约着指纹检测技术在种业领域内的应用效能。今年4月，由农业农村部主办、全国农技中心承办的全国农作物品种DNA指纹库公共平台（简称“DNA指纹库平台”）正式上线运行，实现了“农作物DNA指纹档案”的线上共用共享，解决了品种真实性鉴定中标准样品取样难、耗时长，侵权案件审判时效性差等问题，也为避免同质化育种提供了“参考数据库”。

这么厉害的检测手段具体有什么用，怎么用，实际效果怎样？DNA指纹库平台的上线运行又为种子行业带来了哪些新变化？记者采访了农作物育种单位、种子检验机构、品种管理部门以及法律界专家，从不同侧面揭开农作物DNA指纹检测的“面纱”。

01

不同品种具有的特异性DNA片段组合构成了作物独一无二的“指纹”，用以“验明正身”的前提是建立准确、完整、共享的“指纹库”

“在植物基因组中存在一些特定的区间片段——SSR序列，它们在同一物种中普遍存在，但在不同品种中却高度特异，且不复杂、易鉴定，是区分不同品种的关键位点。这些位点的组合排列就相当于品种的DNA‘指纹’。”从事了20多年SSR分子标记研究的北京市农林科学院玉米研究所主任赵久然回忆，SSR—DNA指纹技术在我国种业领域初露锋芒，是在玉米育种领域。

如何利用SSR序列区分不同品种？

北京市农林科学院小麦研究所研究员庞斌双解释道：“SSR位点是包含1—6个碱基的简单重复序列片段。在同一物种的不同品种中，序列的重复数量各不相同，片段长短存在差异，区分度高，因此，通过检测位点片段的长度，即可作为判别品种身份的有效依据。”

“经过20年发展，SSR标记检测技术至今已相对成熟，在各类农作物种子纯度及品种真实性鉴定中有着广泛应用。近年来，作为第三代分子标记技术，SNP（单核苷酸多态性）标记检测技术飞速发展，凭借其高通量位点和高通量样品的检测优势，数据分析效率、数据兼容性、规模化和自动化水平大幅提升，逐渐受到业内青睐，成为DNA指纹检测技术的又一优势选择。”全国农技中心种子检验处处长金石桥介绍。

“目前来看，SSR和SNP技术各有优势，应用场景相对不同，二者结合应用，能满足目前我国种业发展的不同鉴定需求。”金石桥介绍，为服务种业发展，全国农技中心联合北京市农林科学院玉米所、小麦所以及中国水稻研究所等科研单位，先后联合制定了玉米、水稻、小麦等作物品种真实性、品种纯度的SSR、SNP分子标记法检测标准，为品种鉴定提供了“标尺”。

在各项检测标准中，检测位点的选择是快速区分品种的关键。

庞斌双介绍，在小麦品种真实性SSR分子标记法鉴定标准中，一个位点在不同小麦品种中的片段长度，就能达到30多种类型。通过42个这样高度特异的检测位点，能够很好区分现有小麦品种。

目前，我国玉米审定品种已达1.2万个以上，每年还有近万份组合参加区试，近年来玉米品种真实性鉴定面临新的挑战。北京市农林科学院玉米研究中心研究员王凤格指出，基于玉米品种真实性鉴定SNP标记法鉴定标准中的96个位点，抽取6000多份审定玉米杂交种、3000多份自交系标准指纹进行验证，数据表明区分度分别达到99.14％和99.24％。这意味着，从目前数以万计的品种市场上随便取一份玉米种子进行DNA检测，与DNA指纹数据库比较，就可以确定其真实“身份”。

待检的玉米种子样品。

我们都知道，在刑事案件调查中，通常要将犯罪嫌疑人指纹与数据库中的档案指纹进行筛查、比对，为后续调查获取关键证据。在农作物品种鉴定中，同样需要有这样一套“指纹档案”，为品种“验明正身”提供参考。这就是农作物品种DNA指纹库的价值所在。

那么，这个指纹库是如何建的？

金石桥介绍，为了确保DNA指纹数据库的准确性和完整性，DNA指纹库构建采取平行试验、多家联合、交叉验证的方式。“我们联合组织了28家高水平研究机构、24家高精尖检验机构等全国优势单位，形成了上百家不同类型实验室优势互补、资源共享的DNA指纹检测技术体系。每个样品至少由两家建库单位开展平行实验，结果一致才可进入共享平台。”

据介绍，DNA指纹库平台集纳了玉米、水稻、小麦、向日葵等1.6万个品种的SSR、SNP指纹数据信息，这些信息就构成了农作物品种的“分子身份证”。

“最终，每个品种的检测数据汇集成一个图谱数据库，相当于为每个品种量身定制了独一无二的‘分子身份证’。通过调取‘身份证’信息，就可以直接进行比对。这样一来，既去除了很多重复测定工作，又避免了标准样品来源、鉴定标准不统一的问题。”庞斌双说。

检测机构人员正在对种子样品“DNA指纹数据图谱”进行比对分析。

02

品种数量井喷，同质化问题凸显，检测技术需求迫切，蔬果等小作物尤为突出

随着现代分子育种技术的飞速发展，农作物品种更新换代不断加快。在我国种业“放管服”改革推进下，品种准入通道逐渐放宽，“十三五”时期，国审及省审主要农作物品种超过1.6万个。但伴随品种数量迅速增加，同质化品种多、突破性品种少等现象凸显。

为保护育种者权益，激励育种原始创新，我国1999年开始实行植物新品种保护制度，农业植物新品种权申请总量已经突破5万件，目前已授权近2万件，2017年至2021年的申请量连续五年位居世界第一。

我国已成为全球第二大种子市场，无论在市场监管、破解品种同质化，或是品种权维权执法中，品种真实性鉴定的需求都在快速增长，对于检测技术的需求也越来越迫切。

分作物来看，蔬菜、果树等经济价值高的小作物需求尤为强烈。相较于玉米、小麦等大宗农作物，小作物种业市场监管难度更高，品种维权之路也更加艰辛。北京市农林科学院蔬菜研究所所长温常龙认为，在产业需求上，与主粮作物相比，DNA指纹检测在蔬菜领域的需求更广，作用也更大。

“原因之一在于蔬菜种类多、品种数量大。目前我国非主要农作物品种登记数量已超过2万个，其中蔬菜品种是大头，并且同质化品种较多。其次，蔬菜种子价格昂贵，几块钱一粒的品种很常见，假冒伪劣侵权概率也就比较高。”

温常龙粗略算了一下，普遍来讲，一亩菜田经济收益约是粮食作物的5—10倍，我国蔬菜产值约达2.5万亿元，经济效益占到约整个种植业产值的40％，侵权危害非常大。

温常龙认为，从技术角度来讲，蔬菜小作物检测技术的创建成本并不高，而推广应用价值却很高。“指纹鉴定技术的核心是基因组，而绝大多数蔬菜作物的基因组远远小于玉米、小麦等粮食作物，通常只有粮食作物的几分之一，在检测位点的选择上相对容易。而且，单个蔬菜作物的品种数量相对较少，品种间区分难度并不大。”

技术的推广除了要算“经济账”，还要算好“安全账”。一直以来，由于蔬菜种子经济效益高，蔬菜品种市场上的竞争格外激烈。温常龙说，一个品种选育时间需要8—10年，但寿命却很短，一般3—5年就会被淘汰，更新换代很快。企业选育品种资金、时间成本投入很大，如果育种者合法权益得不到保障，就会大大挫伤企业的研发投入积极性，长此以往将阻碍种业原始创新活力。因此，保障我国蔬菜种源安全和蔬菜种业的健康发展，更加需要高效快速的检测技术来支撑。

03

应用场景丰富多样，既能通过品种验真为权利人挽回经济损失，又能通过同质化筛查让育种方少走“冤枉路”

那么，DNA指纹技术在实际工作中究竟管啥用？

王凤格解释，DNA检测技术主要需要解决的两个关键问题，一是品种真实性验证，二是品种真实性身份鉴定。品种真实性验证在于证实“品”与“名”是否相符，主要是找差异。而品种真实性身份鉴定是指通过与DNA指纹数据比对，为未知品种“验明身份”，验证两个样品是否相同。

近年来，我国DNA指纹检测技术的发展突飞猛进，为适应不同检测需求，针对不同作物颁布了多项行业检测标准。

北京玉米种子检测中心副主任易红梅介绍，以玉米为例，2007年在对SSR技术不断优化完善的基础上，制定了行业标准《玉米品种鉴定技术规程SSR分子标记法》，该标准于2014年进行修订，将毛细管电泳技术纳入标准中，成为司法鉴定中应用最多的作物分子鉴定标准。2014年，借鉴国际植物新品种保护联盟相关测定指南，并结合玉米等分子标准的应用实践，制定并颁布了行业标准《植物品种鉴定DNA指纹方法总则》，推动了其他几十种农作物的分子鉴定技术标准化进程。2022年，随着SNP新型分子技术的成熟完善，颁布了行业标准《玉米品种鉴定技术规程SNP分子标记法》。“随着检测需求的多元化发展，会形成多种标记技术体系，多种检测平台方法分别服务于不同细分领域的检测需求。”

随着技术的不断成熟，DNA指纹检测在种业领域的应用场景也愈加丰富。

在种子市场监管检查、种子打假中，该技术已成为常规技术检测手段。

在春季农作物种子市场检查中，扦样人员在种子经营门店为开展发芽率、品种真实性检测等抽取样品。

据农业农村部种业管理司相关负责人介绍，2016年以来，通过DNA检测技术的应用，在全国种子市场监管中检测出真实性不合格种子样品超过2070批次。近10年来，平均每年检出涉嫌假冒稻品种2％左右、玉米品种5％左右；近5年来，平均每年检出涉嫌假冒小麦品种10％左右，进一步遏制假劣种子流入市场、田间地头，坑农害农。

在品种权纠纷中，通过技术鉴定确定侵权事实获判高额索赔的例子更是数不胜数。2021年发生的“金粳818”植物新品种权纠纷案就是一个典型案例。

江苏亲耕田公司以线下门店、线上微信群的方式帮助推广稻种“金粳818”，在与买家商定交易价格、数量、交货时间后安排送货收款，对外销售白皮袋包装的“金粳818”稻种。作为该品种的独家授权经营企业，江苏省金地种业将江苏亲耕田公司告上法庭，要求其停止侵权并赔偿经济损失。

中国社会科学院法学研究所副研究员李菊丹介绍，在案件审理过程中，通过对侵权材料进行SSR标记法鉴定，确定了“白皮袋”种子真实“身份”，为企业维权提供了“一锤定音”的有力证据。最终，法院确认了鉴定结论，结合其他证据判决侵权人赔偿经济损失及合理开支300万元。

尽管DNA指纹检测技术在市场监管、维权打假中发挥了突出作用，但在技术发展的最初阶段，首先应用的领域却是在育种工作中。

众所周知，品种培育周期长、投入大，而品种同质化无疑是对科研力量、试验经费的浪费。对于育种者而言，避免同质化品种一直是个难点。DNA指纹库平台上线后，集纳了上万份品种信息的数据库为育种单位规避同质化育种提供了参考。

如今，选育出的参试组合，可在品种试验前进行DNA指纹库的筛查比对，如果结果不符合审定要求，参试组合将不再开展品种试验。这相当于为新品种过“审定关”自行设置一次“模拟考”，帮助育种者提前筛除同质化品种，大幅节约育种成本，少走“冤枉路”。

2021年9月，为引导培育突破性品种，提高品种入市门槛，从源头遏制品种同质化问题，《国家级稻、玉米品种审定标准》进行了修订，提高了品种DNA指纹差异要求，将稻、玉米审定品种与已审定品种DNA指纹检测差异位点数由2个分别提高至3个、4个。

“由于审定品种DNA指纹差异位点标准的调整，越来越多的企业开始开展参试前DNA指纹筛查。”易红梅介绍，自2022年4月DNA指纹库平台上线以来，全国不同检验机构累计受理了上千份样品参试前筛查业务。据不完全统计，近30％的参试组合DNA指纹不符合新标规定，以每个参试组合试验费10万元计算，通过DNA指纹库的筛选，每年至少可以节约上亿元的田间测试费用。

04

共享共用让多方受益，库容扩充持续更新

DNA指纹库公共平台的上线运行，标志着我国农作物品种DNA指纹数据真正意义上实现了共建、共享、共用，在我国种业发展中具有里程碑式的意义，也为推动DNA检测技术应用打开了新局面。

目前，该平台具备查询、比对、鉴定、分析等4大功能模块，可为市场打假、品种管理和育种创新等主体提供实时查询比对指定品种指纹异同、筛查推断未知品种身份等服务。

平台上线，检验机构、执法机构及维权企业都能从中受益。

对检测机构来说，在以往鉴定过程中，取样流程需要被告人向国家或各省管理部门提交申请，再从种质库提取标准样品繁殖材料，手续多、耗时长，间接拉长了侵权案件的审理时间。

李菊丹认为，有了DNA指纹库，从材料对外进行检测，到检测数据对外开放，程序上更加轻简，也避免了种质库中标准样品被频繁取样消耗的问题。

多年从事检测工作的刘晋对此深有感触。她所在的农业农村部农作物种子质量监督检验测试中心（深圳）从2011年起主要承担水稻品种真实性检测任务，也接收全国各地农业行政执法单位委托的仲裁检测、育种单位维权打假或育种创新比对等工作。“近年来，每年都有企业和执法机构委托样品进行品种真实性鉴定，但有的因为没有标准样品做对照而无法检测，有的需要企业到农业农村部门申请标准样品再送到机构进行检测，一方面时效性差，一方面也增加了企业的检测成本。”

全国建立统一的DNA指纹库，让检测机构摆脱了品种真实性鉴定中对实物标样的依赖，减轻了各级种业执法部门因为调取标样带来的各种成本，不仅加倍提升检测效率，也改变了长期以来不同作物、不同DNA指纹数据库分散的状况。

据平台承办单位、全国农技中心副主任刘信介绍，今年，平台授权农业农村部推荐的20家种业打假护权检验机构作为首批检验机构用户，这些种子检验机构利用公共平台，承接了大量种子市场监管、执法仲裁、司法纠纷相关的检测任务，累计检测7291批次种子样品，已出具5106份检验报告。

“今年，我们深圳中心准备扩展10个作物真实性项目，因为有了平台的支持，才能确保这些作物品种真实性检测工作的顺利开展。”刘晋信心满满。

对品种管理部门来说，平台上线有助于实现对全国所有区域、不同参试渠道的参试组合DNA指纹联网监测，从而保证了品种区域试验的公正性，从源头上杜绝“仿冒”品种流入市场。

农业农村部种业管理司相关负责人介绍，目前DNA指纹检测已作为三大粮食作物审定的必要条件，通过DNA指纹筛查，每年淘汰申请审定的稻品种5％左右、玉米品种和小麦品种10％以上。在品种登记中，农业农村部在2021年向日葵登记品种专项清理中，撤销了269个“同质化”登记品种，实现了市场品种的“有进有出”，净化了种业市场。

对育种单位和品种权权利人而言，平台为搜查侵权“嫌疑人”、维护育种家权益提供了有效的技术手段。

记者在采访过程中了解到这样一件事：北京市农林科学院玉米研究所育种创新团队选育成的“京糯6”玉米品种在2010年获得植物新品种保护权。该团队利用该自交系组配出了国内推广面积最大的糯玉米“京科糯2000”，取得了非常好的经济效益。但几年后，就发现市场上有多家企业对“京科糯2000”稍做改良后，当作新品种进行审定推广。

但由于“京科糯2000”未申请品种权，缺乏有效的维权手段，只能吃“哑巴亏”。DNA指纹库平台上线后，经筛查发现多个品种组合中直接使用了“京糯6”作为亲本之一，就委托维权公司开展“京糯6”维权工作，目前已和多家单位达成了品种许可使用协议，获得“京糯6”品种许可费上百万元。这让育种创新团队为之一振。

同时，国内多家企业也成为平台上线的受益者。以三北种业为例，通过DNA指纹平台，从制种基地开展品种维权，确认并锁定侵权制种地上万亩，为投诉、诉讼等维权工作固定证据，奠定了获得侵权赔偿或品种许可使用基础。

据全国农技中心数据显示，平台正式上线运行5个月以来，受到了种业界高度关注，种子企业和社会公众踊跃使用，目前平台注册用户已超过500个，访问量突破1万次。

“近期‘三瓜一菜’（西瓜、甜瓜、黄瓜、番茄）指纹数据正在加紧构建，有望不久入库。”刘信介绍，全国农技中心正进一步加大DNA指纹检测标准研发和建库力度，继续扩充作物种类，分批次增加更多作物品种DNA指纹数据。同时，加快补齐新审定、登记品种数据，持续更新指纹信息，尽快建立健全涵盖所有重要农作物品种多种标记类型的全国统一DNA指纹数据库，为全国农作物品种创新和种子市场监管提供共享开放的公共服务平台。

（图片均为资料图）

作者：农民日报·中国农网记者 祖祎祎

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