crisprcas9基因编辑流程概括（Cas9基因编辑技术的发展）
crisprcas9基因编辑流程概括（Cas9基因编辑技术的发展）CRISPR/Cas9的应用领域相较于ZFNs和TALENs，CRISPR/Cas9通过一段与目标DNA片段匹配的向导RNA引导核酸酶识别靶向位点，提高了Cas9核酸酶的特异性；同时，Cas9在sgRNA的引导下以单体蛋白的形式发挥功能，避免了精细复杂的蛋白质设计或组装的需要。CRISPR/Cas9合成简单、周期短、操作简单、效率高，因此是目前研究最多、应用最广泛的基因编辑工具。TALENs的构造与ZFNs类似，由串联的转录激活因子样效应子（TALE）的DNA结合结构域和FokI限制酶组成。由于FokI核酸酶需要二聚化才能发挥作用，TALENs也需要成对作用以切断目标DNA位点。同时TALENs技术也存在脱靶现象、费用昂贵且费时、可能会引起机体免疫反应等问题。CRISPR/Cas9系统主要由Cas9蛋白和单链向导RNA（sgRNA）所组成，在sgRNA的向导下通过碱基互补配对原则，Cas9
基因编辑是一种对靶基因或转录产物进行敲除、插入和定点突变等精确修饰的基因工程技术，主要通过人工核酸酶实现对基因组的特定基因序列的敲除、插入或精确修饰。基因编辑能够高效率地进行定点基因组编辑，故而在基因研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的应用前景。
基因编辑技术的更迭
截至目前，基于DNA核酸酶的基因编辑技术已经过三代更迭，从第一代锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）技术、第二代转录激活子样效应子核酸酶（transcription activator like effector nucleases，TALENs）技术到第三代CRISPR/Cas技术。它们通过在DNA中产生靶向的双链断裂，然后依靠细胞自身修复机制来完成编辑过程。
ZFNs是较早用于基因组编辑的人工合成的限制性内切酶，由特异性识别序列的锌指蛋白（ZFP）和Fokl核酸内切酶组成。DNA切割域的FokI核酸酶必须二聚化以切割DNA。尽管ZFNs技术在多个物种中成功进行了基因编辑，但是锌指蛋白的设计费时费力，成本较高，限制了该方法的大规模应用。
TALENs的构造与ZFNs类似，由串联的转录激活因子样效应子（TALE）的DNA结合结构域和FokI限制酶组成。由于FokI核酸酶需要二聚化才能发挥作用，TALENs也需要成对作用以切断目标DNA位点。同时TALENs技术也存在脱靶现象、费用昂贵且费时、可能会引起机体免疫反应等问题。
CRISPR/Cas9系统主要由Cas9蛋白和单链向导RNA（sgRNA）所组成，在sgRNA的向导下通过碱基互补配对原则，Cas9蛋白可对不同的靶部位进行切割，实现DNA的双链断裂。CRISPR/Cas9系统可用于通过非同源末端连接（NHEJ）修复方式，在DNA切割位点处引入随机突变，也可通过共同注射与DNA同源的工程化DNA载体，通过同源重组修复（HDR）方式引入特定突变或插入。
▲ CRISPR/Cas9双链断裂和修复途径
相较于ZFNs和TALENs，CRISPR/Cas9通过一段与目标DNA片段匹配的向导RNA引导核酸酶识别靶向位点，提高了Cas9核酸酶的特异性；同时，Cas9在sgRNA的引导下以单体蛋白的形式发挥功能，避免了精细复杂的蛋白质设计或组装的需要。CRISPR/Cas9合成简单、周期短、操作简单、效率高，因此是目前研究最多、应用最广泛的基因编辑工具。
CRISPR/Cas9的应用领域
CRISPR/Cas9的出现为人类基因编辑提供了新的可能性，随着近年来分子生物学的快速发展，已广泛应用于众多领域。不仅可用于表达调控和基因功能的研究、细胞动物模型的构建、癌基因和药物靶点的筛选，在基因治疗中更是具有巨大的发展前景，为多种疾病提供了新的治疗方法。
基因治疗通过导入正常基因或者编辑修复缺陷基因，实现治疗疾病的目的。目前，CRISPR基因编辑技术已在多种疾病，如单基因遗传病、眼科疾病、艾滋病及肿瘤等的基因治疗中得到了应用。
此外，基因编辑应用于肿瘤治疗主要是与免疫治疗相结合，尤其是与CAR-T细胞，该方法在白血病、淋巴瘤和部分实体瘤中有巨大的发展前景。利用CRISPR/Cas9系统同时破坏多个基因位点，产生的TCR（T cell receptor）和HLA-I（HLA class I）缺陷的CAR-T细胞可以减少移植物抗宿主病（GVHD）和免疫排斥反应的发生，在开发通用型CAR-T细胞中已被广泛应用。除了产生通用的CAR-T细胞，CRISPR-Cas9技术也可以通过敲除编码信号分子的基因如PD1和CTLA4或编码T细胞抑制性受体的基因来提高CAR-T细胞的功能。
CRISPR基因组编辑工作全流程解决方案
CRISPR/Cas9包含两个主要部分：行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白和具有向导功能的gRNA。CRISPR/Cas9技术的基本工作原理是Cas9蛋白在gRNA的引导下对DNA进行识别和切割。
➤ 设计与构建
使用CRISPR/Cas9进行基因编辑时，首先要进行gRNA设计，gRNA设计是影响CRISPR/Cas9系统编辑效率的关键因素。
据Nature Biotechnology上发表的一篇题为“Design and analysis of CRISPR–Cas experiments”的综述介绍，目前已有超过30种gRNA设计网站可用，并且很多网站都有其独特的应用目标。
gRNA设计需要在基因组中找到合适的靶标序列，长度大约在18–20个核苷酸，并且与PAM（NGG）位点相邻。
张锋实验室开发的CRISPOR是令人熟知的一款gRNA设计工具，可在线设计gRNA，分析潜在脱靶位点，使研究者尽可能选择脱靶效应低的gRNA。CRISPOR在基因敲除的设计方面已应用多年，但要成功敲入基因仍然有一定难度。
MIT学生在学校实验室发明的Benchling拥有CRISPR gRNA在线辅助设计功能，目前全球拥有超过10000名用户，主要提供给各高校实验室免费使用，而其他非学术机构使用则需要收费。
此外，还有E-CRISP、GUIDES、CRISPick、RGEN Cas-Designer等几大软件均拥有类似的功能。然而，以上这些软件均针对国外用户开发，目前国内尚无官方开发的基因编辑设计工具。
CRISPR构建设计是基因编辑技术的关键步骤，如何选择合适的基因编辑设计工具是当下面临的一个重要问题。现今流行的几大软件工具均由国外开发，并未考虑到中国地区用户的应用情况，对于国内很多用户特别是新手而言存在一定的使用障碍，很可能导致研究人员难以快速高效地完成实验设计过程。
为此，作为行业担当者，赛默飞专门设计了Invitrogen™ TrueDesign™基因组编辑工具，只需注册赛默飞中国官方账号即可免费使用。TrueDesign软件嫁接在赛默飞中国服务器上，可以直接从赛默飞中国官网进入并使用，并配备了中文版的操作指南和应用指南，旨在帮助中国地区的客户更方便、更快速地设计实验。
TrueDesign可设计gRNA和DNA供体，用于在任何位置对任何转录本进行SNP替换、插入、删除和大片段替换，支持5个物种的6种基因编辑设计，并且直接关联NCBI等多种国际生物学数据库，可一站式完成设计和订购。
▲ TrueDesign 基因组编辑工具
Invitrogen™ TrueGuide™合成gRNA是即用型的合成gRNA，经过设计和验证可与Invitrogen™基因组编辑工具套件一起使用。预先设计的gRNA旨在使基因敲除效率最大化，且不影响特异性。
▲ TrueGuide合成gRNA
在选择Cas9核酸酶形式时，可使用TrueCut Cas9蛋白v2（货号 A36498，100 µg），这是一种带优化的N端和C端核定位信号的化脓链球菌Cas9蛋白。与其他供应商的产品相比，TrueCut Cas9蛋白v2在测试细胞系（包含免疫、原代和干细胞）中始终具有更高的编辑效率，对困难靶点的编辑效率相比竞争对手高达2倍。
▲ TrueCut Cas9蛋白v2
➤ 递送
目前基于CRISPR/Cas9的治疗技术主要是通过靶向递送来实现的，CRISPR/Cas9系统的递送方式主要包括：物理方法、病毒载体和非病毒载体。其中物理递送方法比较常用的是电穿孔法，与其他递送技术相比，电穿孔对细胞类型的依赖性较小，并且可以有效地将组件转移到细胞中。
Invitrogen™ Neon™转染系统可在CRISPR基因编辑应用中实现出色的切割效率，适用于将Cas9蛋白或Cas9质粒DNA递送至哺乳动物细胞中，包括原代细胞、干细胞和难转染的细胞。与其他电穿孔仪器不同，这款灵活、开放的系统利用优化或用户定义的实验方案，仅需三个简单的步骤，即可实现高质量的转染，每个反应仅需2 x 104个细胞。独特的反应室大大提高了转染效率和细胞存活率。
▲ Invitrogen™ Neon™电转染系统
将研发成果推向临床，助力商业化进程
随着近年CRISPR/Cas9技术的发展，基因编辑技术已在细胞与基因治疗中被广泛使用，一些基因编辑治疗已经进入临床试验阶段。
在临床应用中，对药品质量和生产条件都有严苛的要求。Cas9蛋白的生产成为CRISPR产品临床前研究和临床开发的最大障碍。Gibco™ TrueCut™ Cas9蛋白（CTS™-Prototype）是一种用于临床前研究的Cas9蛋白新标准，可作为工艺过程开发期间进行临床前研究和评价的早期测试材料。它专为临床前研究的严格要求而设计，并按照严格的指导原则进行生产，可确保质量和一致性。
▲ Gibco™ TrueCut™ Cas9蛋白
2020年2月，全球首款免疫治疗产品Kymriah的发明者-宾夕法尼亚大学Carl June教授实验室在Science上发表了一篇题为“CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer”的文章，报告了一项一期临床试验，评估了CRISPR/Cas9基因编辑在3例晚期癌症患者中的安全性和可行性。
他们利用赛默飞提供的CRISPR/Cas9产品，在提取到的病人T淋巴细胞中破坏了三个基因TRAC、TRBC和PDCD1的表达，以提高抗肿瘤免疫，基因改造后的T细胞回输至患者体内后耐受性良好 证明了利用CRISPR/Cas9在T细胞中编辑多个基因进行免疫治疗的可行性和安全性，代表人们在基因工程T细胞疗法又取得了显著成果。
此外，目前大多数的电转染都只适用于小规模的研究；而临床应用则需要兼顾处理规模和速度，稳定的效率与较高的细胞活性，以及整个生产工艺的合规性。因此，将小规模电转染实验结果放大到临床生产规模，成为了制约研发成果推向实际应用的瓶颈。
Gibco™ CTS™ Xenon™大规模电转染系统能够无缝地集成和应用到细胞治疗工作流程中，覆盖从工艺开发到临床生产的全流程需求。1mL电转染腔室可实现高效的工艺开发，5–25mL电转染套件可直接应用到商业生产中。这种更大处理量的耗材可集成到封闭式细胞治疗生产系统中，实现无菌的电转染工艺。
▲ Gibco™ CTS™ Xenon™大规模细胞电转染系统
新药研发通常是指从新化合物的发现到新药成功上市的过程，需要历经药物发现、药物临床前研究、新药临床试验（IND）申报、药物临床研究、药品注册申请与审批以及上市后持续研究。
其中，IND 申请是承上启下的关键阶段，已成为新药研发成功与否的关键制约因素。CMC是申报资料中的重要组成部分，IND中CMC的信息一般包括原料药、制剂的组成、生产工艺、稳定性和生产控制、安慰剂等信息。原料药纯度关乎安全性，制剂性能关乎有效性，直接影响临床试验结果。
赛默飞应用的产品原料可全程追溯，并且能够提供充分有力的文书支持：包括原产地证明（CoO）和分析证书（CoA）。全部产品向FDA提交药物主文档登记（Drug Master File），节约产品审查和评估时间，缩减新药临床申报的准备工作。
赛默飞支持基础至临床的无缝转化，始终坚持更严格的生产规范，按照细胞和组织产品辅助材料标准制造，包括 USP <1043>、Ph.Eur. 5.2.12 和 ISO 20399 -1、-2 和 -3；在 FDA 注册的基地遵循21 CFR Part 820 的原则进行生产。无血清、无异种来源或完全无动物来源成分的配方，避免潜在风险。所有产品均经过了深入全面的质检，包括生物负载、内毒素、支原体、宿主残留核酸和蛋白质等。赛默飞四月大促活动，还有更多优惠活动等您来拿！
赛默飞的专家团队拥有逾50年的GibcoTM培养基经验和30年以上的GMP规范生产经验，可帮助用户完成从研究到商品化阶段的监管过程，帮助解答细胞生产过程中出现的一系列问题。
总结
随着近年来研发投入的不断增加，中国的科研实力正在迅速崛起。在研究火热的基因编辑领域，中国是最早启动CRISPR临床的地区之一，越来越多的企业开始投入该领域，竞争已日益激烈。与传统小分子、大分子药物相比，基因编辑药物研发难度大、生产复杂、成本高，如何提高研发效率、缩短药物研发周期、提高药品研发质量、降低药物研发成本，是各大企业需要共同面对的问题。赛默飞致力于成为基因编辑行业担当者，TrueDesign填补了国内基因编辑设计工具的空白，助力研究人员迈出基因编辑药物研发的第一步。再加上RUO和CTS的无缝转化和各种技术支持，可全力协助中国客户快速、高效地解决研发到商业化过程中遇到的任何问题。
