猪传染病微生物学诊断方法（猪繁殖与呼吸综合征流行现状及分子流行病学研究）

猪传染病微生物学诊断方法（猪繁殖与呼吸综合征流行现状及分子流行病学研究）五、青岛易邦实验室近三年的ORF5基因测序结果分析四、类NADC30、类NADC34毒株致病力分析国内类NADC30毒株CHsx1401在实验室条件下攻毒，21天内猪只并没有出现死亡，致病性低于HP-PRRSV毒株[12]，类NADC30毒株HNjz15 也得到相似的结果[13]。国内类NADC34致病性：国内类NADC34毒株 HLJDZD32 -1901 对仔猪致病性中等且低于类NADC30 PRRSV[14]。另一个类NADC34毒株ZDXYL-China-2018-1的攻毒实验证明，与HP-PRRSV株相比，并未引起攻毒猪的死亡，是一种中等毒力毒株。单个毒株或许并不能代表一类病毒的毒力，但以目前国内的实验结果来推测，各 PRRSV 亚型对仔猪的致病性的排序为：HP-PRRSV>类NADC30 PRRSV>类NADC34 PRRSV。二、美国蓝耳病谱系研究美国有专家统计了

猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)于1987年在美国首次报道，随后欧洲和亚洲等各地陆续报道了本病的发生。1991年荷兰学者和美国学者先后分离和确定了本病的病原。

PRRSV为有囊膜的单股正链RNA病毒，属于套式病毒目，动脉炎病毒科，分为两个基因型：Genotype1和Genotype2。Genotype1也称为欧洲型，Genotype2也称为美洲型。美洲型蓝耳病病毒按照ORF5序列，分为至少9个谱系(lineage1～9)和37个亚谱系(sublin-eage)；Nsp2是PRRSV 中最长且变异程度最大的非结构蛋白，不同PRRSV的Nsp2基因具有显著的差异，也可作为分类依据。

一、PRRSV在我国的流行自20世纪90年代中期在我国发生和流行以来，已经20余年。据田间流行优势毒株的不同，可大致分为三个阶段：经典毒株流行阶段（1996-2006年）、高致病性毒株（HP-PRRSV）流行阶段（2006-2013年）、类NADC30和高致病性毒株共同流行阶段（2013年至今）。

我国有关PRRS的描述最早见于1995年，代表性的分离毒株分别为CH-1a、BJ-4[1 2 3]，均为美洲型毒株。2006 年之后出现的高致病性毒株（HP-PRRSV）给我国养猪业造成了重大危害，代表毒株为JXA1、HUN4。2008年，NADC30毒株首次于美国爱荷华州爆发呼吸系统疾病的猪群中发现，2013年之后，类NADC30毒株开始在我国流行^[4]。2014年，类NADC34毒株在美国爆发流行，对美国的养猪业造成巨大损失^[5]，2017年，张洪亮教授团队在辽宁省首次检测到类NADC34毒株，2019-2020年，福建、黑龙江、河南等省份都分离到类NADC34毒株^{[6 7 8 9]}。我国的流行毒株总体分属于四个谱系：lineage1、lineage3、lineage5、lineage8。目前lineage1(类NADC30毒株等)和lineage8(HP-PRRSV等)是当前田间主要的流行毒株，其中lineage1谱系是当前的优势谱系。

二、美国蓝耳病谱系研究美国有专家统计了美国2009-2019年的27875个蓝耳病序列，其中PRRSV-2（美洲型）为26853个，占比96.3%，对其中的26831个PRRSV-2序列进行了进一步分析，美国的流行毒株总体分属于三个谱系：lineage1、lineage5、lineage8，与中国的情况不同，谱系1占据了样本中的大部分^[10]。

三、限制性片段长度多态性（RFLP）分析的原理及应用

蓝耳病的RFLP分型是根据酶MluI、HincII和SacII在ORF5限制位点上的酶切模式形成3个数字代码^[11]。基因谱系是基于ORF5分子特征的遗传进化分析，RFLP是基于ORF5基因的多态性分析。中美两国在PRRSV分类模式上存在差别，中国以分子特征（Nsp2缺失和ORF5序列比对）分型，美国以RFLP(ORF5)进行分型。以类NADC34为例，当前类NADC34毒株ORF5基因以RFLP1-7-4居多，但同时也存在1-4-4、1-7-2、1-7-3等类型，RFLP 分类方式无法代表具有同一致病特性的一类毒株， RFLP基因分型在深入了解病毒的致病性方面无效，以分子特征（Nsp2缺失和ORF5序列比对）分型更符合当前国内复杂的疾病形式。

四、类NADC30、类NADC34毒株致病力分析国内类NADC30毒株CHsx1401在实验室条件下攻毒，21天内猪只并没有出现死亡，致病性低于HP-PRRSV毒株^[12]，类NADC30毒株HNjz15 也得到相似的结果^[13]。国内类NADC34致病性：国内类NADC34毒株 HLJDZD32 -1901 对仔猪致病性中等且低于类NADC30 PRRSV^[14]。另一个类NADC34毒株ZDXYL-China-2018-1的攻毒实验证明，与HP-PRRSV株相比，并未引起攻毒猪的死亡，是一种中等毒力毒株。单个毒株或许并不能代表一类病毒的毒力，但以目前国内的实验结果来推测，各 PRRSV 亚型对仔猪的致病性的排序为：HP-PRRSV>类NADC30 PRRSV>类NADC34 PRRSV。

五、青岛易邦实验室近三年的ORF5基因测序结果分析

结果分析：

①各个基因型占比情况：2019、2020年高蓝的比例仍高于类NADC30，2021年起NADC30比例高于高致病性蓝耳病，类NADC30毒株已经成为国内主流。

‍②类NADC34检出情况：2020年检测到2%类NADC34毒株，2021年检测到3.33%。可以推测，随着猪场的复养和国外引种增加，类NADC34毒株的威胁将逐渐增加。

六、欧洲型蓝耳病病毒（PRRSV1）在我国的流行情况1991年，荷兰学者分离到毒株 Lelystad virus(LV)并完成了全基因组测序^［15］。此后，欧洲多国先后分离到PRRSV1。我国有关欧洲型毒株的研究相对较少，Zhou Z等于2011年分离到四株PRRSV1毒株^［16］。Wang X．等从 2011 年的样本中分离到一株与疫苗毒株 Amervac 核苷酸序列高度同源的 PRRSV1 毒株 GZ11-G1，怀疑与引进疫苗免疫种猪有关^[17]。2014年Nan hua Chen等从发病猪的血清里分离到一株Amervac疫苗毒与田间毒株BJEU06-1的重组毒株^[18]，这提示我们需要加强国外引种的蓝耳病监测。

随着荧光定量PCR等检测方法的应用，PRRSV1的检出变得普遍。其中广东^[19]和广西^[20]地区的检测显示欧洲型 PRRSV在中国存在扩散，可能会造成该病毒在一定区域内的流行，给养猪场带来一定的危害。

参考文献：

[1] 郭宝清，陈章水，刘文兴，等．从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J]．中国畜禽传染病，1996(2)：1 5．

[2] 杨汉春，管山红，尹晓敏，等．猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与初步鉴定[J]．中国兽医杂志，1997，23(10)：9-10．

[3] 陈博文，孙颖杰，罗长保，等．猪繁殖和呼吸系统综合征的血清学检测及病毒的分离和鉴定(初报)[J].中国兽医杂志，1996，22(5)：6-8．

[4] 周 峰，常洪涛，赵 军，等，2012-2013年猪繁殖与呼吸综合征病毒河南流行株的分离鉴定及分子流行病学调查[J]．中国兽医学报，2014，34(9)：1398-1404，1410．

[5] Van Geelen A M Anderson T K Lager K M et al. Porcine reproductive and respiratory disease virus: Evolution and recombination yields distinct ORF5 RFLP 1-7-4 viruses with individual pathogenicity[J]. Virology 2017 513:168-179.

[6] 张洪亮 张文立 相丽润 等.2017年我国输入性北美1-7-4分支PRRSV的基因组序列分析[J].中国预防兽医学报 2018 40(10):875-879

[7] Liu J Wei C Lin Z et al. Full genome sequence analysis of a 1-7-4-like PRRSV strain in Fujian Province China[J]. PeerJ 2019 7(5):e7859.

[8] Xie C Z Zhuo H Zhang H et al. Pathogenicity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (ORF5 RFLP 1-7-4 viruses) in China[J]. Transboundary and Emerging Diseases 2020(Pt 6).

[9] Hu Xu 1 Chao Li 1 Wansheng Li 1 .Novel characteristics of Chinese NADC34-like PRRRSV during 2020-2021 Transbound Emerg Dis 2022 Feb 19

[10] Domestic Swine Disease Monitoring Program • Field Epidemiology • Iowa State University (iastate.edu)

[11] Ronald D Wesley et al. Differentiation of a Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Vaccine Strain from North American Field Strains by Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of ORF 5[J]. J Vet Diagn Invest 1998.

[12] ZHOU L，YANG B，XU L，et al. Efficacy evaluation of three modified ⁃ live virus vaccines against a strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus NADC30-like［J］. Veterinary Microbiology，2017，207：108⁃116.

[13] LI X，WU J，TAN F，et al. Genome characterization of two NADC30 ⁃ like porcine reproductive and respiratory syndrome viruses in China［J］. Springerplus，2016，5（1）：1677.

[14] Xin Ma PeiXin Wang RiTeng Zhang et al. A NADC30 like PRRSV Causes Serious Intestinal Infections and Tropism in Piglets[J] Vet Microbiol 2022 May:268

[15] WENSVOORRT G，TERPSTRA C，POL J M，et al． Mystery swine disease in the Netherlands: the isolation of Lelystad virus［J］． Vet Q，1991，13 (3): 121-130．

[16] ZHOU Z，LIU Q，HU D，et al． Complete genomic characterization and genetic diversity of four European genotype Porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates from China in 2011［J］．Virus Genes，2015，51(3):375-384．

[17] WANG X，YANG X，ZHOU R，et al． Genomic characterization and pathogenicity of a strain of type 1 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］． Virus Res，2016，225:40-49．

[18] CHEN N，LIU Q，QIAO M，et al． Whole genome characterization of a novel Porcine reproductive and respiratory syndrome virus 1isolate: genetic evidence for recombination between Amervac vaccine and circulating strains in P.R.China［J］． Infect Genet Evol， 2017，54:308-313．

[19] 韩晓亮 韦应芳 孙彦阔 等. 2017年广东省首株欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其全基因组特征分析[J]. 中国兽医科学 2019 49(1):9.

[20] 赵硕 段群棚 何 颖 等 广西猪繁殖与呼吸综合征病毒感染情况调查及其欧洲型毒株ORF5基因变异分析 中国动物传染病学报 2021-08-27