pcr技术中dna聚合酶的作用（高保真DNA聚合酶Pfu-sso7d表达与纯化详细教程）
pcr技术中dna聚合酶的作用（高保真DNA聚合酶Pfu-sso7d表达与纯化详细教程）-20冰箱卡那霉素储存液（10mg/mL MP实验室通常使用浓度）主要材料BL21(DE3)感受态细胞（商业化产品或自制）LB培养基（固体以及液体）
“五亩之宅，树之以桑，五十者可以衣帛矣”
——孟子
本教程提供了快速高保真DNA聚合酶Pfu-sso7d的表达与纯化步骤。Sso7d为双链DNA结合蛋白，关于Sso7d融合技术带来的好处详见Wang Yan的文章1。
本文主要参考Barrick Lab2的纯化方案，同时跟自身纯化经验进行细节优化。
主要材料
BL21(DE3)感受态细胞（商业化产品或自制）
LB培养基（固体以及液体）
卡那霉素储存液（10mg/mL MP实验室通常使用浓度）
-20冰箱
紫外分光光度计
French Press(更普及的是超声破碎仪)
IPTG（1M储存液）
PMSF或者其他蛋白酶抑制剂
一次性离心管耗材，50mL，15mL ，如康宁品牌
高速离心管（Nalgene）
高速离心机（最好带冷冻功能）
控温水浴锅
Ni-NTA填料（Qiagen）
即用型透析袋（Snakeskin，10kDa MWCO）
磁力搅拌器
PCR仪器
台式离心机以及其他实验室常用仪器与耗材。
表达质粒
pET28a-Pfu-sso7d。序列参考Barrick Lab。
缓冲液
裂解/柱平衡液：
50 mM NaH2PO4
300mM NaCl
10-20mM 咪唑
使用NaOH调节pH至8.0，25℃
清洗液：
50 mM NaH2PO4
300mM NaCl
40 mM 咪唑
使用NaOH调节pH至8.0，25℃
如使用AKTA或类似层析系统，可以通过层析系统形成线性咪唑浓度，因此不必准备清洗液。手动纯化时，也可以使用平衡液与洗脱液按比例配置得到合适浓度。但是化学或者说数学不好的人，最好提前备好。
洗脱液：
50 mM NaH2PO4
300mM NaCl
250 mM 咪唑
使用NaOH调节pH至8.0，25℃
聚合酶储存缓冲液
50% 甘油
30 mM Tris-HCl，pH 8.0
0.1 mM EDTA
0.1% NP 40(或者其他去垢剂，如TWEEN 20)
1 mM DTT
蛋白表达
规模：2个500mL的LB液体培养。
第一天：转化pET 28a-Pfu-sso7d质粒到含Kan抗性的LB平板。
第二天：挑取单克隆菌落，以2-3mL液体培养摇菌。最好做一次菌落/菌液PCR以验证单菌落非污染，引物为通用引物T7、T7Ter，或者Pfu序列特异性引物。
晚上转接10mL的液体培养基，过夜培养。
第三天：以1%的量接500mL LB培养基，加入0.5%-1%的葡萄糖以抑制基底（渗漏）表达，减低毒性。
37℃ 200rpm震荡培养，至OD600到0.6-0.1。加入终浓度0.5mM-1 mM的IPTG。
继续培养2-4小时。
如夜间加班做实验，则收集菌体后立即进行破碎。如不打算加班，则收集菌体后-80℃保存。
蛋白纯化
第四天（或者第N天，菌体在-80℃冰箱可以存放很长时间）
以1g湿重-10mL 裂解液的比例加入裂解液，悬浮。加入PMSF至终浓度1mM。
超声破碎。
在70℃加热15-30 min。此时宿主蛋白大部分变性失活。
4℃ 以最大或者接近最大转速离心30 min，取上清。
使用0.22uM滤膜过滤，滤液即可加入到纯化柱内进行柱纯化操作。
（在此描述步骤为依靠重力的手动Ni-NTA纯化操作方法）
使用5倍柱床体积（Column Volume，CV）的去离子水清洗纯化柱，除去20%保存液，然后以5倍CV的裂解液平衡纯化柱。
以5倍CV 的清洗液洗杂蛋白。
使用约1CV的洗脱缓冲液，洗脱目的蛋白。
透析：
透析旨在除去高浓度咪唑以及NaCl，将酶置换到储存缓冲液中。
因酶储存缓冲液含50% 甘油，因此通常透析结束时酶溶液体积会缩小。
剪切合适长度的一段Snakeskin透析膜，夹住一头，将洗脱的酶溶液加入透析膜中，再用夹子封住另一端口。
4℃透析3小时以上，或者过夜之后换新的储存液。一般三次换液可认为透析完全。
酶浓度与活性测试
将透析后所得酶转移到合适的管内，-20℃保存。
取其中小量，稀释成一系列梯度，通过SDS-PAGE检测纯度与蛋白大小。
活性测试
将梯度浓度的Pfu-sso7d与商品的酶进行PCR，进行活性对比，如Phusion，或者NEB Q5 DNA polymerase。
可在NEB购买商品化的反应Buffer。或者自己配置
以下Buffer配方可用
5X HF Phusion Buffer
150 mM Tris-HCl pH 10
50 mM KCl
50 mM NH4OAc
10 mM MgSO4
0.5% Triton X-100
0.5 mg/mL BSA
PCR反应体系与热循环参数
Reaction Mix
|
Reagent |
Volume/ul |
|
Water |
12.4 |
|
dNTP (10mM) |
0.4 |
|
5× buffer |
4 |
|
Primer F (10uM) |
1 |
|
Primer R (10uM) |
1 |
|
Template (2ng/ul) |
1 |
|
Diluted polymerase |
0.2 |
|
Cycle |
Temperature |
Duration (secs) |
|
Initial denaturation |
98 |
30s |
|
Repeat Cycle 30× | ||
|
Denaturation |
98 |
10s |
|
Annealing |
69 |
20s |
|
Extension |
72 |
30s / kbp |
|
End Cycle | ||
|
Final extension |
72 |
5m |
可以用简单的模板，如质粒DNA扩增2-6kb片段进行酶活浓度测定
如需更为精确优化配方，还需更多测试。
至此，一个可以使用多年的快速高保真Pfu聚合酶就基本完成了。经历如此复杂的过程其核心动力在于经济考虑。
试想一个PCR试剂用量大的实验室一年可以从PCR Mix自产自足中节省多少经费？
更为重要的是，PCR试剂自由，那种做起PCR来不要钱的感觉，真的很爽！
成本核算
Pfu-sso7d基因合成：2600bp，约2600元
Snakeskin:约1600一卷
其它，能够表达纯化蛋白的实验室常备，边际成本可以接近于零。
时间：看是谁的时间，这个无法衡量。
MMLV、Pfu-sso7d国外学者自产（homemade）鉴定图
图片源自网络平台3
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作为一家新兴的分子生物学酶研发、生产、销售公司，我们致力于为客户提供性能先进、质量可靠的生命科学科研试剂。同时我们也注意到部分客户对于某些产品价格偏高的不满，以及对DIY的渴望，由此，我们也试想能否取得某种平衡：
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参考文献：
1.Yan Wang et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. Nucleic Acids Res. 2004; 32(3): 1197–1207.
2.https://barricklab.org/twiki/bin/view/Lab/ProtocolsReagentsPfuSso7d
3.Vonesh et alMcQ – An open-source multiplexed SARS-CoV-2 quantification platform. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.12.02.20242628v1.full
4.https://barricklab.org/twiki/pub/Lab/ProtocolsReagentsPfuSso7d/6his-pfu-sso7d-pET28.gbk
附录
pET28a-Pfu-sso7d序列4
