血小板膜纳米载体的研究进展：人主动脉内皮细胞的应用
血小板膜纳米载体的研究进展：人主动脉内皮细胞的应用人主动脉内皮细胞能生成诸如t-PA和PAI-1等抗凝和血栓形成因子；在TNF-alpha的调节下，人主动脉内皮细胞能改变其生长特性，产生GM-CSF等细胞因子，在细胞表面表达ICAM-1，并产生大量的NO和内皮素。许多内皮水平的过程多可以通过内皮细胞的体外培养进行研究，因此，HAEC非常适用于研究和认识血管病变和衰老的分子机理。 人主动脉内皮细胞采用酶解法制备而来，vWF、Factor VIII呈阳性，细胞纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。 内皮细胞构成了血管和其下组织的交界面。内皮细胞功能的变化是动脉粥样硬化的发病机理中的关键因素。内皮细胞能合成分泌凝血系统和纤溶系统中的活化因子和抑制因子，同时也能合成和分泌影响着血小板粘附和聚集的某些介质。内皮细胞还可以释放具有调控细胞增殖和血管壁张力功能的分子。
一、背景
人主动脉内皮细胞（Human Artery Endothelial Cells）来源于成年人主动脉组织，其是组成主动脉腔面单层扁平上皮样细胞，大多呈梭形，它所产生和分泌的生物活性物质对维持血管张力，调节血压，抗血栓形成等有重要作用，在高血压，心、脑血管疾病的发病机制中有重要病理生理学意义。
人主动脉内皮细胞采用酶解法制备而来，vWF、Factor VIII呈阳性，细胞纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
内皮细胞构成了血管和其下组织的交界面。内皮细胞功能的变化是动脉粥样硬化的发病机理中的关键因素。内皮细胞能合成分泌凝血系统和纤溶系统中的活化因子和抑制因子，同时也能合成和分泌影响着血小板粘附和聚集的某些介质。内皮细胞还可以释放具有调控细胞增殖和血管壁张力功能的分子。
人主动脉内皮细胞能生成诸如t-PA和PAI-1等抗凝和血栓形成因子；在TNF-alpha的调节下，人主动脉内皮细胞能改变其生长特性，产生GM-CSF等细胞因子，在细胞表面表达ICAM-1，并产生大量的NO和内皮素。许多内皮水平的过程多可以通过内皮细胞的体外培养进行研究，因此，HAEC非常适用于研究和认识血管病变和衰老的分子机理。
二、应用
用于SIRT3基因干扰后对ox-LDL刺激的人主动脉内皮细胞ICAM-1、E-selectin表达的影响研究：
探讨人SIRT3与内皮细胞损伤过程中炎性因子的调控关系 进一步揭示SIRT3在动脉粥样硬化发展过程中的作用。
研究方法：
1、干扰序列的筛选
⑴人主动脉内皮细胞培养：人主动脉内皮细胞 用内皮细胞培养基 1%内皮生长因子 5%胎牛血清的培养液在37℃、5%CO2条件下贴壁培养 选择3-7代生长状态良好的细胞用于实验。
⑵分组与转染：将生长状态良好的细胞随机分为空白对照组、阴性对照组、转染试剂对照组、SIRT3siRNA(1、2、3、4)组。待细胞70%-80%融合时用转染试剂hiperfect进行转染。转染试剂对照组只加转染试剂不加干扰序列。阴性对照组添加阴性对照序列和转染试剂。转染24h后检测相关指标。
⑶显微镜观察细胞形态变化。
⑷荧光倒置显微镜观察阴性对照组荧光蛋白表达。
⑸qRT-PCR检测各组SIRT3mRNA表达。
⑹Western blot检测各组SIRT3蛋白质的表达。
2、SIRT3干扰后检钡ox-LDL刺激的人主动脉内皮细胞SIRT3mRNA ICAM-1、E-selectin蛋白的表达。
⑴实验随机分为空白对照组、siRNA组、(20、30、40μg/mL)ox-LDL组、siRNA (20、30、40μg/mL)ox-LDL组。ox-LDL各组分别按浓度加入ox-LDL刺激6h；siRNA为筛选出的最佳SIRT3干扰序列 siRNA ox-LDL组为转染24h后加入ox-LDL刺激6h。
⑵qRT-PCR检测各组SIRT3mRNA的表达。
⑶流式细胞仪检测CAM-1、E-selectin抗体的平均荧光强度值。
结果：
干扰序列筛选结果
⑴光学显微镜下 与空白对照组相比 SIRT3siRNA各组的细胞多数体积增大 细胞均质性降低 细胞间隙增大。这些特征在SIRT3siRNA2组较明显。
⑵与光学显微镜下同一视野对比 阴性对照90%以上细胞显示绿色荧光。
⑶与各对照组相比 4条SIRT3siRNA序列均在不同程度上下调了SIRT3mRNA的表达(P均<0.05)。其中：SIRT3siRNA2组干扰效果最好 沉默效率为88.616%。(4)4个SIRT3siRNA组分别与各对照组相对灰度值相比 差异均有统计学意义(P均<0.05)。
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