基因剪切详细过程：首次捕获到基因编辑工具剪切DNA全过程的结构变化

基因剪切详细过程：首次捕获到基因编辑工具剪切DNA全过程的结构变化https://www.nature.com/articles/s41594-019-0258-2.pdf论文链接： 在该研究中，低温冷冻电镜结构提供了在Cas9-sgRNA切割底物DNA分子时前所未有的一系列SpCas9的结构'快照'（如下图）。在对单个切割反应进行成像并对单个颗粒进行广泛的三维分类和细化后，研究者确定了三种主要状态：状态I代表在HNH-和RuvC介导的切割之前的检查点中间体，而状态II和III显示重排，催化后立即发生并转化为随后的产物结合中间体。研究表明在酶活性期间偶联的大规模重排和结构域稳定化在调节SpCas9的切割效率和特异性中起关键作用。 研究表明，检查点中间体显示HNH结构域的活性位点相对于靶链中的切割位点距离约30°并且旋转〜180°（见下图a）。重要的是，REC2结构域此时在空间上阻断了对该DNA链的接近。在切割之后，后催化状态显示HNH结构域经历了显着的重

在过去几年中，由于其简单，灵活，一致和高效，CRISPR-Cas9系统及其衍生系统彻底改变了遗传研究和基因组编辑。充分了解Cas9酶在生物物理和结构水平的反应，对于安全有效地使用该系统用于研究和治疗疾病应用中非常重要。虽然之前有大量的研究解析了Cas9酶 - 产物复合物的结构模型，然而，当前模型主要依赖于DNA切割之前的结构，其在不存在添加的Mg 2 或来自催化失活的Cas9突变体中获得。在切割DNA期间和之后的具有催化能力的Cas9复合物的高分辨率结构还没有获得。

2019年7月8日，Nature Structural & Molecular Biology杂志在线发表了来自加拿大英属哥伦比亚大学Sriram Subramaniam课题组等题为"Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9"的研究论文。该研究通过低温冷冻电镜首次解析了Cas9酶在精确切割DNA链的过程中的高分辨率三维图像。因此，该研究显示了CRISPR-Cas9切割DNA的动态模型，有助于开发出更高效、更精确的基因编辑系统。

之前研究表明，Cas9核酸内切酶包括一个HNH核酸酶结构域和一个RuvC-like核酸酶结构域，并且参与了crRNA的成熟过程和crRNA介导的DNA切割过程。Cas9的HNH核酸酶结构域切割与crRNAs互补的DNA链，而RuvC-like结构域切割另一条非互补链，从而在原始间隔序列内产生一个DSB，恰在PAM上游第3和第4个核苷酸之间。

图. Cas9核酸内切切割DNA模型（来源于网络）

在该研究中，低温冷冻电镜结构提供了在Cas9-sgRNA切割底物DNA分子时前所未有的一系列SpCas9的结构'快照'（如下图）。在对单个切割反应进行成像并对单个颗粒进行广泛的三维分类和细化后，研究者确定了三种主要状态：状态I代表在HNH-和RuvC介导的切割之前的检查点中间体，而状态II和III显示重排，催化后立即发生并转化为随后的产物结合中间体。研究表明在酶活性期间偶联的大规模重排和结构域稳定化在调节SpCas9的切割效率和特异性中起关键作用。

研究表明，检查点中间体显示HNH结构域的活性位点相对于靶链中的切割位点距离约30°并且旋转〜180°（见下图a）。重要的是，REC2结构域此时在空间上阻断了对该DNA链的接近。在切割之后，后催化状态显示HNH结构域经历了显着的重排并且具有对齐的侧链和Mg2 结合口袋以用于水解磷酸二酯键（见下图b）。出乎意料的是，在产物结合状态下，HNH结构域已经变得无序，并且REC2结构域已经重新获得对靶链的控制（见下图c）。这种结构域的重新排序导致切割后与DNA的广泛接触，并且可能有助于SpCas9与其靶DNA结合的异常稳定性。因此，解析这些结构以提高酶的保真度和效率将是非常有用的。

因此，该研究提出了Cas 9-sgRNA和DNA复合物以及Mg2 存在下的结构。在溶液中捕获了三种不同的状态，提供了Cas9切割其DNA靶标的机制。并且基于这些结构发现，提出了Cas9催化的RNA指导的DNA切割的修订模型，为以后开发更高效和精准的基因编辑工具提供了理论支持。

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