基因数据库如何建立：曾瑄教授突破桎梏

基因数据库如何建立：曾瑄教授突破桎梏文库构建是NGS检测中的重要一环。实际应用过程中，RNA-based NGS在面对FFPE等低质量样本组织太少时面临挑战，且对实验室环境要求高，需要提高防污染质控。搭载了 “一步法快速构建扩增子文库的方法”的肺癌8基因试剂盒，应用于四川大学华西医院的“肺癌早期精准诊断关键技术的建立与临床应用”项目，获得国家科技进步二等奖。“一步法”专利技术是基于扩增子技术的建库方法，根据目标扩增子设计上下游融合引物，包括接头序列和目标扩增子特异性上下游引物序列。通用引物包括通用接头序列和barcode序列。为提高特异性，所有引物均加入了特定修饰。相比之前的技术，“一步法”扩增子建库技术样本起始量需求低，普通建库捕获技术需200-500ng DNA，且每一步均有DNA损失，而“一步法”建库仅需20ng DNA，且仅需1-3张FFPE切片。此外，“一步法”建库技术操作简单快捷，相比传统建库方法节省大量时间。另

融合变异基因是指两个基因的全部或者一部分的序列相互融合为一个新基因的过程，主要由染色体的重排或转录过程中的错误剪接所造成。常见融合变异基因包括ALK、ROS1等，以ALK为例，检测方法主要包括荧光原位杂交技术（FISH）、免疫组化技术（IHC）、实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）等传统检测方法及以二代基因测序（NGS）为代表的新型检测技术。传统检测方法虽不可或缺，但存在诸多弊端，因此NGS技术的应用及改进，尤其是“一步法”专利技术的实现，有望满足日益增长的临床及科研需求。基于此，在中华医学会病理学分会第二十七次学术会议暨第十一届中国病理年会上，北京协和医院曾瑄教授应邀结合临床实际，深度探讨NGS技术的优势及其“一步建库技术”在融合基因基因检测方面的巨大潜力。

曾瑄教授演讲

迎来曙光，NGS技术助力融合基因检测

融合基因检测方法有多种，传统方法如FISH、IHC、RT-PCR等面临诊断过程漫长、样本耗竭、灵敏度低等挑战，而且较为依赖检验人员的判断经验，主观性较强。而NGS技术的诞生则有效弥补了一些短板。一项研究对1070例肺癌FFPE样本进行DNA基因检测，结果显示NGS技术检测融合基因更为灵敏。此外，亦有研究证实，NGS检测可区分融合基因亚型。以ALK为例，EML4-ALK常与ALK基因发生融合，有21种亚型，不同亚型对于ALK抑制剂响应存在差异。而传统的IHC、FISH技术无法细分ALK融合亚型。通过NGS检测可以检出所有的ALK融合形式，进行ALK融合亚型细分从而指导ALK阳性患者临床治疗。

引领未来，RNA-based NGS技术优势尽显

NGS检测技术包括DNA-based NGS和RNA-based NGS，因原理及模板的差异，二者稍有不同。总体而言，RNA-based NGS在实际应用过程中优势更为显著。首先RNA-based NGS具有更高灵敏度。有些内含子非常长，DNA探针较难以全面覆盖；有些内含子则因为包含大量重复序列，设计探针较为困难，灵敏度会受到影响。另外，RNA-based NGS检测能够有效避免融合的漏检。中国医学科学院一项针对非小细胞肺癌ALK/ROS1/RET融合基因研究，3787例NSCLC患者，分别进行利用ARMS、DNA-based NGS、RNA-based NGS方法进行融合基因检测。结果显示对140例样本进行RNA NGS检测，仅有10%的样本检出驱动基因变异（假阴性），以MET和ROS1漏检最常见。除了上述优势，RNA-NGS检测还能够有效避免MET 14 skipping漏检，比DNA NGS检出更多MET exon 14跳跃突变。

基于此，2021新版NCCN指南推荐RNA-based NGS进行融合、跳跃检测。指南明确指出，NGS是MET基因14外显子的基本检测方法，RNA-NGS是更好的检侧手段；对于RET重排的检测，基于NGS的方法具有很高的特异性，RNA-NGS比DNA-NGS更适合用于融合检测。

风云再起，“一步法”建库技术再掀基因检测领域波澜

文库构建是NGS检测中的重要一环。实际应用过程中，RNA-based NGS在面对FFPE等低质量样本组织太少时面临挑战，且对实验室环境要求高，需要提高防污染质控。搭载了 “一步法快速构建扩增子文库的方法”的肺癌8基因试剂盒，应用于四川大学华西医院的“肺癌早期精准诊断关键技术的建立与临床应用”项目，获得国家科技进步二等奖。“一步法”专利技术是基于扩增子技术的建库方法，根据目标扩增子设计上下游融合引物，包括接头序列和目标扩增子特异性上下游引物序列。通用引物包括通用接头序列和barcode序列。为提高特异性，所有引物均加入了特定修饰。相比之前的技术，“一步法”扩增子建库技术样本起始量需求低，普通建库捕获技术需200-500ng DNA，且每一步均有DNA损失，而“一步法”建库仅需20ng DNA，且仅需1-3张FFPE切片。此外，“一步法”建库技术操作简单快捷，相比传统建库方法节省大量时间。另外，“一步法”建库技术可有效降低交叉污染风险，其仅需单次纯化和定量。更重要的是，经“一步法”建库，文库质量高，可最大限度减少引物对之间的差异。

目前“一步法”建库方法已取得了丰硕成果，在组织切片及液态活检方面，主要应用的试剂盒产品包括人类8基因突变联合检测试剂盒（半导体测序法）（国械注准20203400072）、脑基础项检测试剂盒、人甲状腺全周期基因检测试剂盒、人EGFR突变基因检测试剂盒（11基因）、人尿路上皮肿瘤风险基因检测试剂盒等，而且已获批。以人类肺癌8基因检测试剂盒为例，涵盖指南推荐的必检基因，同时获批用于吉非替尼等药物的伴随诊断检测，为NSCLC患者提供更为精准的诊疗建议。

总结

在肿瘤融合基因检测领域，NGS检测具有灵敏度高、节省样本的优点，尤其是RNA-based NGS更加直观准确。而用于NGS检测的“一步法”建库技术在RNA层面检测肿瘤融合基因，并且具有快、简、少、准的特点，为患者及临床医生提供更精准的用药信息。希望未来“一步法”技术更广泛地应用于临床科研，相关领域的工作者群策群力，为医疗事业的发展做出贡献。