双酵母杂交原理及示意图：酵母双杂交中常见问题答疑

双酵母杂交原理及示意图：酵母双杂交中常见问题答疑（1）可以选择多个报告基因（HIS，ADE，MEL1）进行更为严格的筛选，每个报告基因的上游调控区各不相同，从而大大减少假阳性；解决方法：01 酵母双杂交出现假阳性的原因？如何解决？可能原因：根据酵母双杂交的原理，若BD融合的诱饵蛋白有单独激活作用，或者其激活作用能被外来蛋白激活，从而激活下游报告基因的表达，最终会导致假阳性。因此，在进行实验时需要作严格的对照实验，对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定，以排除假阳性。

原理简介

Fields在1989年提出了酵母双杂交技术，打开了蛋白质相互作用筛选的快捷通道。这项技术的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究。GAL4包括两个结构域，即位于N端的DNA结合域（DNA binding domain，BD）和位于C端转录激活域（Activation domain，AD）。BD能够识别位于GAL4效应基因（GAL4-responsive gene）的上游激活序列（Upstream activating sequence，UAS），并与之结合，AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独分别作用并不能激活转录进行，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，转录启动子下游基因并使其表达。

在酵母双杂交系统中，BD与X蛋白融合，AD与Y蛋白融合，如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物，AD与BD会在空间上充分接近，重新构成结构域，启动报告基因序列的转录。拥有BD质粒的酵母菌可以在某一缺陷培养基上生长，拥有AD质粒的酵母菌可以在另一种缺陷培养基上生长。通过接合（mating）或共转化使酵母菌同时拥有AD与BD质粒，如果BD上的诱饵蛋白与AD上的目的蛋白存在相互作用，这样的酵母菌株可以在三缺及四缺的培养基上生长，并启动β-半乳糖苷酶的基因进行转录。

图 酵母双杂原理

01 酵母双杂交出现假阳性的原因？如何解决？

可能原因：

根据酵母双杂交的原理，若BD融合的诱饵蛋白有单独激活作用，或者其激活作用能被外来蛋白激活，从而激活下游报告基因的表达，最终会导致假阳性。因此，在进行实验时需要作严格的对照实验，对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定，以排除假阳性。

解决方法：

（1）可以选择多个报告基因（HIS，ADE，MEL1）进行更为严格的筛选，每个报告基因的上游调控区各不相同，从而大大减少假阳性；

（2）通过适当提高AbA或3-AT的浓度；

（3）报告基因整合到染色体上，可以使基因表达水平稳定，消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。

02 获得的阳性克隆，PCR检测有多条片段。

可能原因：一个酵母细胞可以包含多个捕获蛋白。

解决办法：选取单克隆划板2-3次，进行蓝白斑筛选，直到没有分离，找到阳性克隆，用于后续的实验。

03 诱饵蛋白具有自激活活性，能够单独激活报告基因的表达怎么办？

（1）有些较弱的自激活作用可以通过添加适量的3-AT进行抑制，若较高的3-AT不能抑制自激活则需要对诱饵蛋白进行截短表达。

（2）若该蛋白是一个转录因子，具有转录激活域，则需要去掉转录激活结构域；如果不是转录因子但仍具有较强的转录激活活性，需要将诱饵蛋白具有激活活性的区域去除，再进行后续的操作，但这样操作有可能影响蛋白间的互作。

（3）可以考虑换用Co-IP技术进行互作蛋白的鉴定，该技术不受诱饵蛋白自激活的限制。

自激活检测的主要作用有两个：其一，需要根据诱饵蛋白自激活的程度调整AbA的浓度或3-AT的浓度；其二，检测诱饵蛋白是否具有毒性，如果菌落生长过慢，则表达的蛋白可能具有毒性，需要使用低拷贝的质粒表达诱饵蛋白。

04 核体系文库和膜体系文库如何选择？

如果诱饵蛋白定位在膜上或含有跨膜结构域则选择膜体系文库，如果诱饵蛋白定位在细胞核中则选择核体系文库。有跨膜区的诱饵蛋白也可考虑去除跨膜区或者选用定位在胞内的区域使用核体系文库进行筛库，但是这样做可能会影响目的蛋白的结构与功能，存在一定风险。

蛋白跨膜结构可以使用以下网站进行预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/

05 膜系统酵母双杂筛选如何选择诱饵载体？

膜系统酵母双杂根据诱饵基因的蛋白跨膜方式可以选择不同的载体，确定诱饵基因的蛋白结构以后根据下面的表格可选择适当的载体：

下面提供几个分析蛋白结构的网站：

（1）分析膜蛋白的细胞内和细胞外区域的网站：

http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/

http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/phobius/

（2）具体分析蛋白的信号肽序列，以及N端是否存在cleavge site的网站：

http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

06 酵母双杂交的筛选流程？

（1）先分析目的蛋白的结构，判断是否为膜蛋白或者是否有跨膜结构，如果有跨膜结构则需要根据具体蛋白结构选用合适的诱饵载体，如果无跨膜结构一般用pGBKT7诱饵载体；

（2）将目的基因构建至诱饵载体后转化酵母进行自激活检测与毒性检测，根据自激活检测结果确定合适的筛选条件；

（3）将cDNA文库质粒转化至菌株中，涂布在合适的筛选平板中培养4-7 d，从筛选平板中挑取阳性克隆点板于四缺板中再次确认与诱饵蛋白相互作用的蛋白；

（4）对筛选得到的阳性酵母菌株用通用引物进行cDNA片段扩增与测序，并对该片段的编码序列在genebank中进行比较，研究其与已知基因在生物学功能上的联系。

07 杂交效率不高怎么办？

酵母文库筛选可以用Mating以及质粒转化两种方法。

Mating是指将诱饵菌液（pGBKT7-Bait/AH109）与酵母文库Y187菌液混合后进行培养。Mating效率不高，可能是杂交细胞数量不够，对诱饵菌株进行液体培养过夜时，应挑选大的、新鲜的克隆进行培养，适当增加诱饵蛋白的液体培养量，并保证酵母文库工作菌液滴度在10^8 CFU/mL以上，同时，还可以延长杂交时间，直至通过显微镜镜检观察到存在三叶草形状的合子产生，再进行后续操作。

质粒转化效率低可以采用以下方法解决：

（1）检测文库质粒DNA的纯度，如果可以的话，考虑重新用乙醇纯化；

（2）DNA-BD/诱饵蛋白很可能是有毒的；

（3）配制新鲜的配养基，并做对照转化；

（4）严格按照操作说明书进行操作。

08 3-AT的筛选浓度怎么选择，有没有建议的使用浓度范围？

正常情况下HIS基因会有轻微泄露，导致没有相互作用的克隆也能在三缺平板上微弱生长，这种情况可以通过添加适量的3-AT进行抑制。理想情况 10mM浓度的3-AT平板会有少量酵母生长，20mM浓度的3-AT不能或极少有酵母生长。如果在80mM浓度的3-AT平板上还能生长酵母，说明诱饵蛋白的自激活活性太高，不能用于双杂交筛选。

09 诱饵蛋白的大小是否对酵母双杂交的结果有影响？

虽然文献报道从8-750个氨基酸都有酵母双杂交成功的案例，但是分子量比较大的蛋白在酵母中可能存在折叠错误的情况，因此，在实际的工作中，分子量比较大的诱饵蛋白在酵母中寻找互作蛋白的成功率会低于中等大小分子量的诱饵蛋白。

10 筛选培养基上克隆太多。

可能原因：诱饵蛋白可能存在自激活，自身就可以激活下游筛选标记的表达；或者是筛选条件过于宽松。

解决办法：选用更为严格的筛选条件抑制诱饵蛋白的自激活活性，如果效果不理想，可以删除诱饵蛋白能够引起自激活活性的结构域，再用于酵母双杂交进行实验。

11 筛选培养基上克隆太少。

可能原因：酵母双杂交效率低、筛选条件太严格或与目的蛋白相互作用的蛋白太少。

解决办法：延长杂交时间，提高杂交效率；放宽筛选条件；与目的蛋白相互作用的蛋白太少是诱饵蛋白本身结构造成的，无法通过实验来弥补。

12 酵母双杂与酵母单杂的文库可以共用吗？

对于核文库，酵母单杂与酵母双杂的文库可以共用，它们的构建方法是一样的，只是酵母单杂的诱饵基因是核酸，一般是启动子序列，而酵母双杂的诱饵基因是蛋白。

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酵母建库及筛库

酵母单杂

酵母双杂

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