循环肿瘤细胞捕获方法的研究进展：循环恶性肿瘤细胞检测系统新技术应用与临床诊断价值
循环肿瘤细胞捕获方法的研究进展：循环恶性肿瘤细胞检测系统新技术应用与临床诊断价值亲和性富集法根据结合的靶细胞是CTC还是白细胞，可分为阳性富集法和阴性富集法。阳性富集法主要利用特异性抗体与肿瘤细胞表面抗原进行特异性结合来富集CTC。上皮标志物在正常上皮细胞和上皮肿瘤（即癌）上表达，但在白细胞上不存在，因此经常用于区分肿瘤细胞和正常血细胞。上皮细胞粘附分子（EpCAM）是最常用于上皮表型CTC阳性富集的细胞表面标志物。此外，由于细胞骨架蛋白对于上皮细胞具有特异性，细胞角蛋白家族成员（如CK8，CK18和CK19）已经成为检测具有上皮表型癌症患者CTC的“金标准”标记物。阴性富集法也称白细胞去除法，通常用识别CD45或CD14的特异性抗体与白细胞结合，从而去除全血中的白细胞。最典型的亲和性富集法富集CTC的技术平台是美国强生公司研发的Cellsearch系统。Cellsearch系统利用EpCAM与包含特异性抗体的磁珠结合，在外加磁场的作用下会发生分流的原理，达到分离提纯
作者：韩超 杨艳
单位：广州阳普医疗科技股份有限公司/广州安方生物科技有限公司
循环肿瘤细胞是指自发或因诊疗操作脱离实体瘤原发灶或转移灶而进入外周血循环的肿瘤细胞，其已被研究证实是包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结直肠癌等在内的多种癌症的诊断和预后标志物，如果能够在血液中快速检测到循环肿瘤细胞并对其数量、种类和特性进行评估，有助于监测肿瘤复发、评价药物疗效以辅助治疗决策及调整治疗方案。但目前循环肿瘤细胞的检测方法均存在一定的局限性，研究出具有更高灵敏度和特异性的检测新方法将有助于循环肿瘤细胞在临床上的应用。本文将介绍一种新型循环恶性肿瘤细胞的检测技术，从仪器的检测原理，检测分析流程等方面做一简述。
一、循环肿瘤细胞在临床的应用价值
研究表明，当癌症发生转移时，肿瘤细胞能逃离原发肿瘤而进入患者的外周血中而形成所谓的循环肿瘤细胞（circulating tumor cells CTCs）。当其转移到合适的器官或组织所形成的基质微环境时，就可能形成新的肿瘤。这种实体瘤或病灶转移时所释放的肿瘤细胞是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素，目前其已被研究证实是包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结直肠癌等在内的多种癌症的诊断和预后标志物。因此，如果能够在血液中快速检测到循环肿瘤细胞并对其数量、种类和特性进行评估，有助于监测肿瘤复发、评价药物疗效以辅助治疗决策及调整治疗方案，能对患者进行更好的治疗与护理。
它与传统影像诊断和穿刺活检相比，CTCs检测优势显著，可更加敏感地发现疾病的变化，更科学、更迅速的评价某一治疗方案的效果。而且检测、分离、富集CTCs只需抽取患者少量外周血，结合其它检测方法，很容易实现对患者的实时监测，掌握疾病进展和治疗效果等重要信息。同时CTCs可作为分析患者肿瘤生物学特征的实时样本，可以发现患者的实时生物学变化，并根据结果及时调整治疗方案，实现实时的个体化治疗。
二、传统的循环肿瘤细胞检测技术
长期以来 人们对捕捉和检测CTCs的技术进行了大量的研究但未取得突破性进展，主要原因在于循环肿瘤细胞的稀有性（每1ml血中仅存在1～10个CTCs，却含有109个正常血细胞）及异质性（不同肿瘤细胞之间，相同肿瘤的不同细胞之间基因与表型不同）。因此出现了众多CTCs的富集捕获方法，但各有利弊。目前主流的方法有两种：基于亲和性的富集法和基于物理特性的富集法。亲和性富集法主要是通过细胞表面特异性表达的蛋白质生物标志物分离靶细胞，包括正向捕获CTC的阳性富集法和负向去除白细胞的阴性富集法。物理特性富集法主要是根据CTC的大小、密度、力学和介电性能等物理特性将CTC筛选分离出来。
亲和性富集法根据结合的靶细胞是CTC还是白细胞，可分为阳性富集法和阴性富集法。阳性富集法主要利用特异性抗体与肿瘤细胞表面抗原进行特异性结合来富集CTC。上皮标志物在正常上皮细胞和上皮肿瘤（即癌）上表达，但在白细胞上不存在，因此经常用于区分肿瘤细胞和正常血细胞。上皮细胞粘附分子（EpCAM）是最常用于上皮表型CTC阳性富集的细胞表面标志物。此外，由于细胞骨架蛋白对于上皮细胞具有特异性，细胞角蛋白家族成员（如CK8，CK18和CK19）已经成为检测具有上皮表型癌症患者CTC的“金标准”标记物。阴性富集法也称白细胞去除法，通常用识别CD45或CD14的特异性抗体与白细胞结合，从而去除全血中的白细胞。最典型的亲和性富集法富集CTC的技术平台是美国强生公司研发的Cellsearch系统。Cellsearch系统利用EpCAM与包含特异性抗体的磁珠结合，在外加磁场的作用下会发生分流的原理，达到分离提纯CTCs的目的。Cellsearch作为目前唯一经美国食品与药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准用于检测CTCs的平台，其优势包括系统半自动化，检测迅速，重复性好的优点。但是研究表明，有一部分循环肿瘤细胞（约30%）的表面可能没有这种特异标志物，所以其不能保证捕获的高效益，存在较高的假阴性率。
物理特性富集法根据物理性质来分离CTC，包括大小、密度、力学和介电性质。这种类型的分选方法操作过程简单，捕获效率高，能够实现高通量富集，成本远远低于CellSearch，特别是其不依赖细胞表面抗原的表达，所以捕获的细胞数量及类型会更多。根据物理特性分离的CTCs，其优势除了避免不同抗原对结果的影响，还能够收集到形态更好的肿瘤细胞，方便后续研究。这类方法的典型代表是采用特殊的微孔过滤装置将循环肿瘤细胞与其它细胞进行分离或捕获，事实上，CTC一般都比正常的白细胞和红细胞大，如果将微孔的孔径优化，就有可能根据细胞的大小来分离肿瘤细胞，但问题是在癌症病人的外周血中的有可能的检测到的CTC数目极少，目前所提出的各种微孔过滤技术方案在捕获循环肿瘤细胞的同时，也截留了大量的白细胞。如此大量的白细胞易造成膜上微孔的堵塞，产生过多的干扰而使得检测灵敏度下降。
CellSearch系统其分选及检测有稳定的自动化设备，因此其循证医学数据充分，在临床应用上其预后评估的价值被大家认可。但技术上的缺陷（仅捕获上皮性CTC且仅能实现计数评估预后）导致其无法进一步让患者或医生受益，这可能是该系统自2016年初开始停止销售的原因。另一款通过CFDA认证的平台Cellcollector也是基于EpCAM抗体捕获CTC 虽然其采集器置于血管内可收集到大量的CTC，但由于其操作复杂，临床实用性有限。
考虑到CTC的异质性，非亲和富集技术可能具有更好的广谱性。由于不依赖特异性表面标志物，非亲和富集所得到的CTC可以较好的保持原有的状态以利培养扩增及更全面的分析。非亲和富集的优势还在于无需对样品进行前处理和富集后可用多种抗体标志物来鉴别，因此具有临床应用和基础研究的优势。同时，CTC富集技术的难点还从富集到检测全流程的自动化及标准化，包括样品前处理、细胞富集、富集后分子标记和自动扫描成像等。由于血液的复杂性和工艺流程的不确定性，非标准化、非自动化的操作很难确保检测结果的可靠性。因此，除检测原理外，配套开发具有高度可重复性的CTCs检测系统也应成为产业化的重点。只有这样才能为临床提供可靠和实用的工具，为CTCs检测、研究癌症的多样性以及生物学特征提供更多的可能。
三、新型的循环肿瘤细胞富集材料
这是一项来自法国居里夫人实验室的研究成果帮助循环肿瘤细胞在富集方法上实现质的突破。其核心为一种锥形孔滤膜集成的微流控芯片。根据循环肿瘤细胞（CTC）与血细胞在尺寸大小和物理特性的差异性，特别是细胞核大小以及细胞核形变能力的差异性（一般来讲CTC尺寸较红细胞和白细胞偏大，且CTC较正常血细胞不容易形变），结合微流控技术，在一定范围的负压及流速条件下，通过微流控芯片中集成的锥形孔滤膜过滤掉绝大多数血细胞及白细胞，同时俘获血液样本中的循环肿瘤细胞。
基于肿瘤细胞大小通过滤膜分离CTC的技术由来已久，且在乳腺癌、肺癌、胰腺癌等多个癌种中得到初步验证。但其诟病主要是孔径大小没有普适性，易漏掉一些尺寸小的CTC；其次白细胞的干扰严重，易导致堵塞以及影响后续的检测判断。除此以外，还需考虑滤膜材料的选择，滤膜的平整度（影响成像分析），过滤时流速的控制（影响细胞活性）以及批量化生产技术等。基于传统滤膜的局限性，该团队创新设计制造了一种锥形微孔阵列滤膜，这种直径13mm的圆形滤膜，其中有效孔区域直径为9mm 孔周期为20um 包含20万左右锥形微孔（图1）。
这种滤膜的创新性主要体现在：首先，锥形孔可使白细胞快速通过，不易堵塞。考虑大小一定的白细胞完全进入柱形或锥形微孔中并将细胞简化为一个异相液滴（图2）。
根据流体力学计算可得液滴在微孔中的附加压强差为：
R1和R2分别为靠近微孔进口和出口的液滴曲率半径。当无外部压差时，柱形微孔中的液滴曲率半径R1=R2，即
，因此白细胞会卡在孔中不动，会使通量减少，如果在此时保持通量不变，膜两边的压强差则会增加，使得被捕获的目标细胞也有可能在高压下被冲走。而且，白细胞在柱形微孔中的堵塞及膜两边压强差的增加都会使白细胞的受损，从而分泌有利血液凝结的因子，加快了微孔的堵塞。锥形微孔中的液滴曲率半径R1<R2，即
，因此白细胞可自动逃逸，因而可以使膜的通量保持不变。其次，锥形孔可增加流体通量减少跨膜压差。根据流体力学计算可得流体通过单个柱形微孔的流量：
其中a为微孔半径，h为流体粘滞系数，
为微孔两边的压差，L为微孔长度。显然，在a、h和
不变的条件下，减小微孔长度可使流量增加。对锥形微孔进行极限近似，即锥形角趋近90度（小口径不变，大口径无限大）时，L趋近为零，Q为最大。可见当微孔密度及其它条件不变时，锥形微孔膜的通量较柱形微孔膜大。在一定通量的情况下，锥形孔滤膜两端的压差要远比柱形微孔小可以避免对捕获细胞的损伤。
最后，鉴于锥形孔可使白细胞快速通过，减小堵塞，保持通量，因此，我们可减小小孔孔径，从而减少部分小的CTC的丢失。对比传统的柱状微孔(8微米孔径)过滤方式，这种锥形孔滤膜的小孔孔径可减小到6微米，完全可俘获所有尺寸的循环肿瘤细胞。同时，锥形微孔的设计可最大化减少血细胞的堵塞，保持通量，维持极低的跨膜压差，从而确保已经俘获的循环肿瘤细胞维持更好的细胞形态，而且不会被挤压通过微孔造成丢失。
表1对比了目前各种基于滤膜法的性能参数，这种锥形孔滤膜各项性能表现优异。
四、高度集成化的循环肿瘤细胞检测系统
1.分选染色检测系统：自主研发的稀有细胞分离染色仪操作便利性及效率方面：比Cellsearch系统，样本处理更简单，与预处理液混合后即可上机实验。启动后，设备将自动完成分选及染色的全流程，整个流程仅需3小时。另一方面，稀有细胞分离染色仪结合血液流变学以及细胞生物力学性质，配置设备在分选过程中自适应调节，从而在针对同一病人的不同时间点采样检测，不同病人样本检测等不同情况下，可确保CTC检测稳定性，为临床动态检测CTC以判断预后提供保证。
此技术上的创新使本产品能为临床检验提供高效便捷的操作及产品更好的重复性（CTC重复性CV值定为≤8% HER2重复性CV值定为≤10％）。且确保了CTC检测的稳定性为患者预后判断提供了保证。
2.自动扫描显微镜和图像分析系统：分选及染色完成后，需要对滤膜上截流的细胞进行分析，目前CTC的鉴别主要依赖于光学显微成像技术，成像扫描好坏将直接决定CTC检测准确性。成像技术主要技术是软件算法。传统的常用的基于一阶导数算子对边缘灰度值变化比较剧烈且噪声较小的图像可取得较好的效果，但对于边缘复杂、采光不均匀的图像，效果则不够理想。为此，我们创新提出了一种新的迭代腐蚀的分水岭算法。该算法基于数学形态学腐蚀操作，进行行迭代腐蚀，使得粘连细胞得以分开，得到最终的细胞种子点图像，利用分水岭分割算法提取分水岭边界，并在二值化细胞图像中画出，最终实现对所有细胞形成准确的分割图像以便软件准确分析。
此技术上的创新使本产品能自动筛鉴别CTC细胞及正常血细胞，减少人工工作量，而且数字化的判别标准能提高检测结果的准确性。
3.CTC的判定标准：CTC的标准主要还是来源于Cellsearch系统：细胞核阳性（DAPI ）、核直径大于某一阈值、肿瘤标记物阳性（CK ），同时白细胞标记物阴性（CD45-）。但从临床结果看，这些标准并不能完全分选出各种子类的CTC。一方面因为提取的特征有限；另一方面，提取的特征没有进行精确的定量；最后，相关阈值通过细胞系来定义，与试剂样本中的差异性较大。为此，我们选择一批相关特征作为备选特征，包括：细胞核面积、长短轴、类圆度、平均亮度；细胞质CK表达面积、类圆度、长短轴、平均亮度、总亮度、方差、灰度共生矩阵；细胞质CD45表达面积、类圆度、长短轴、平均亮度、总亮度、方差、灰度共生矩阵。通过对一定规模的数据进行统计分析，使用随机森林算法进行监督学习，根据特征的重要性排序，挑取高权重特征，提高分类模型的效率。最终选择的特征为：细胞核面积、类圆度、平均亮度；细胞质CK表达面积、平均亮度、方差；细胞质CD45表达面积、平均亮度。根据以上选择的特征参数，通过监督学习，找到合适的阈值，对膜上细胞进行精准分类。
此技术上的创新使本产品能更准确的鉴别CTC及CTC的HER2蛋白表达情况 使得产品在转移性乳腺癌患者的预后评估方面与影像学预后评估方面具有相关性，CTC数量的动态变化与肿瘤标记物展现了较好的一致性，同时在不一致的趋势上，CTC与临床评估更吻合，展现了更好的临床吻合度。且CTC-HER2状态评估与组织活检HER2状态具备较高的一致性。详细数据见临床试验报告。
注：本文来源于《临床实验室》杂志2021年第5期“分子诊断”专题
