表征智能体的三种方式：力显智能前沿进展

表征智能体的三种方式：力显智能前沿进展2.1 SynCAM1-HRP报告基因的亚突触分布图1. 使用syncam1-辣根过氧化物酶(HRP)-融合蛋白进行过氧化物酶介导的接近度标记—研究结果SynCAM1，是一种突触细胞粘附蛋白，在发育过程和成熟突触中只定位于兴奋性突触。将HRP或APEX2插入SynCAM1的363个氨基酸位置，位于最后一个免疫球蛋白(Ig)结构域和跨膜(TM)结构域之间。这将HRP置于SynCAM1的细胞外区域的基部，形成了一个SynCAM1-HRP融合蛋白，在这个位置插入的重组蛋白或标签并不会改变SynCAM1的突触定位。SynCAM1是一种单通道的1型膜蛋白，在生物发生后需要通过分泌途径运输到达细胞表面。为了限制过氧化物酶融合蛋白介导的生物素标记，通过分泌途径进入细胞表面，包括突触表面，需要一个含有极性连接物的非膜渗透的生物素-酚化合物。因此，作者选择了biotin-AEEA-phenol，在过氧化氢存

“ 哺乳动物的大脑由功能多样化的突触类型组成，将不同的神经元群体连接成网络，使复杂的行为和对外部和内部线索的反应成为可能。理解这种多样性将是定义大脑连接的基础。突触是一种特殊的神经元细胞-细胞接触，在整个神经元群中，不同突触的分子组成不同，以实现异质连接模式和功能这些分子成分指导突触发生、成熟和分化在发育和成年，突触的分子多样性进一步受到神经元活动和可塑性变化等过程以及分泌因子的控制。除了突触前和突触后的特化外，突触间隙现在被认为是突触的一个完整的隔间，有助于它们的结构和功能组织。”

为了绘制裂缝蛋白质组，作者采用过氧化物酶介导的接近标记方法，并将融合于辣根过氧化物酶的兴奋性突触细胞粘附蛋白SynCAM1(HRP)作为培养的皮质神经元的报告基因。该报告基因通过共聚焦显微镜测量标记兴奋性突触，并通过3D dSTORM超分辨率成像确定其定位于突触间隙的边缘区 用细胞表面的非膜生物素-酚化合物限制标记进行接近标记，用无标记定量(LFQ)质谱结合膜和突触表面蛋白的比率HRP标记来鉴定兴奋性裂解的蛋白质组学含量。鉴定了新的候选裂隙蛋白，并选择了受体型酪氨酸蛋白磷酸酶zeta并成功验证。作者在本文中支持了过氧化物酶介导的邻近标记在突触裂蛋白质组学中的强大适用性，以及它在理解健康和精神疾病和成瘾等疾病的突触异质性变化方面的潜力。

《Mapping the Proteome of the Synaptic Cleft throughProximity Labeling Reveals New Cleft Proteins》

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研究结果

1、SynCAM 1-过氧化物酶融合蛋白过氧化物酶介导的突触间隙的邻近标记

SynCAM1，是一种突触细胞粘附蛋白，在发育过程和成熟突触中只定位于兴奋性突触。将HRP或APEX2插入SynCAM1的363个氨基酸位置，位于最后一个免疫球蛋白(Ig)结构域和跨膜(TM)结构域之间。这将HRP置于SynCAM1的细胞外区域的基部，形成了一个SynCAM1-HRP融合蛋白，在这个位置插入的重组蛋白或标签并不会改变SynCAM1的突触定位。SynCAM1是一种单通道的1型膜蛋白，在生物发生后需要通过分泌途径运输到达细胞表面。为了限制过氧化物酶融合蛋白介导的生物素标记，通过分泌途径进入细胞表面，包括突触表面，需要一个含有极性连接物的非膜渗透的生物素-酚化合物。因此，作者选择了biotin-AEEA-phenol，在过氧化氢存在的情况下，外源性biotin-AEEA-phenol诱导了表达SynCAM1-APEX2的HEK293T细胞表面的生物素化

图1. 使用syncam1-辣根过氧化物酶(HRP)-融合蛋白进行过氧化物酶介导的接近度标记

2、绘制兴奋性突触裂蛋白质组

2.1 SynCAM1-HRP报告基因的亚突触分布

此前，作者利用培养神经元中的STED和3DdSTORM超分辨率成像和脑切片中的免疫电镜分析了内源性SynCAM1的突触表达。这些方法确定了SynCAM1定位于兴奋性、不对称突触的突触裂，主要存在于突触后膜，并在突触后密度的边缘被检测到。为了分析SynCAM1-HRP报告基因的定位，作者在HRP的c端插入了一个flag标签。用该结构物转染培养的大鼠海马神经元，并采用双色三维dSTORM超分辨率成像进行分析。FLAG免疫染色检测SynCAM1-HRP和突触后兴奋性支架蛋白Homer和3D dSTORM显示超分辨SynCAM1-HRP位于Homer簇附近(图2A)。SynCAM1-HRP集合的分布在PSD边缘~100nm内，与内源性SynCAM1在培养大鼠海马神经元中的亚突触分布一致。这表明，基于syncam1的报告基因将HRP靶向到突触裂隙，并在裂隙边界区富集。

图2. dSTORM揭示突触SynCAM1-HRP的表达和生物素化

2.2 SynCAM1-突触接近标记的HRP验证

突触裂隙是一种不被细胞膜包围的开放的细胞隔室。这需要进一步提高突触裂中蛋白质鉴定的特异性。一种比率过氧化物酶介导的标记方法以前曾应用于突触裂蛋白和线粒体膜间间隙蛋白。我们的目的是实施这种比率测量方法，并比较由SynCAM1-HRP裂隙报告基因生物素化的蛋白与细胞外融合到跨膜结构域的广泛表面表达的HRP。

为了验证这两种报告基因在神经元中正确生成生物素化反应产物，我们使用重组AAV(rAAV)在体外14天(div)转导到分离的大鼠皮质神经元的培养物中。RAAV允许培养的神经元进行大规模转导，并滴定病毒颗粒以平衡高转导效率和中等蛋白过表达。在添加过氧化氢和生物素-AEEA-苯酚后，神经元在21div处进行短暂的过氧化物酶介导的接近标记。使用中和病毒素-dylight488对生物素化产物进行染色，发现在SynCAM1-HRP表达神经元中，兴奋性突触位置的生物素-蛋白偶联物，并有一些突触外标记。

相比之下，转导到培养的大鼠皮质神经元中显示了树突上的生物素标记，但在突触位置没有富集。这些结果支持了SynCAM1-HRP和Membraie-HRP报告基因可以分别从兴奋性突触分裂和神经元细胞表面获得邻近标记的蛋白样本，用于比率分析。

图 3 SynCAM1-突触接近标记的HRP验证

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研究总结

过去的十年中，随着超分辨率技术的整合，作者的数据通过STORM技术支持了使用突触HRP报告基因的接近标记是识别裂隙分子组成的可靠方法，这是一个以前的生化研究不容易获得的隔间。未来的应用可以包括测试在改变突触结构的疾病相关条件下，突触间隙组成的变化，这提供了证据，表明脑裂隙成分有助于暴露药物滥用后的突触变化，因此，裂缝蛋白的邻近标记可能为动态裂缝在形成突触中的作用提供有价值的见解，并为未来的蛋白质组学研究绘制这些变化提供了依据。

在本研究中，这项2014年诺贝尔化学奖的发现已在国内实现产业化。宁波力显智能科技有限公司(INVIEW)现已发布超高分辨率显微系统iSTORM，采用3D随机光学重构技术、高精度细胞实时锁定技术、多通道同时成像技术等，以纳米级观测精度、高稳定性、广泛环境适用、快速成像、简易操作等优异特性，获得了超过50家科研小组和100多位科研人员的高度认可。

参考文献：

1. Mapping the Proteome of the Synaptic Cleft throughProximity Labeling Reveals New Cleft Proteins

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