了解一代测序基本原理及操作程序：靶向测序的应用场景与扩增子建库技术路线
了解一代测序基本原理及操作程序：靶向测序的应用场景与扩增子建库技术路线基因功能研究。靶向测序通用的两条技术路线：杂交捕获和多重PCR科学研究病原体/环境微生物鉴定16s扩增子测序；耐药性分析；病毒嵌合人基因组分析等 。
近年来，靶向测序凭借成本低、数据利用率高、组合灵活等优势，在临床的疾病辅助诊断、治疗以及肿瘤基因检测中发挥出积极的作用。
靶向测序应用场景在哪里？
突变基因测序
癌症基因测序；遗传疾病筛查；免疫疗法预测等。
病原体/环境
微生物鉴定
16s扩增子测序；耐药性分析；病毒嵌合人基因组分析等 。
科学研究
基因功能研究。
靶向测序通用的两条技术路线：杂交捕获和多重PCR
杂交捕获是指将基因组打断为片段后，加入事先设计好的探针，把这些片段“抓”出来，从而达到富集的目的；多重PCR是指在一个体系中进行多个PCR反应，PCR的引物铺设在感兴趣的DNA区域，多轮反应后，目标区域就显著富集了。多重PCR技术小、快、灵，实验周期短，但覆盖范围较小；杂交捕获技术流程稍显繁琐，同时具有更高的背景噪音，但非常适合超多重靶标检测。既然两种方式各有优劣，那我们要如何选择靶向富集的方法？
从上面的比较可以看出，使用扩增子建库富集目的DNA的方法在多个方面显著优于杂交捕获方式，特别是在起始量低，用时较短和成本较低方面。
扩增子建库主要是通过多重PCR的方式来实现，多重PCR由Chambehian于1988年提出，随着测序技术的发展，使对得到的扩增子进行高灵敏度＆高分辨率的检测成为了可能，且从传统的4-5重，几十重发展到了现在的上千重甚至上万重的超多重PCR，再辅以二代测序技术，可在遗传病诊断，肿瘤基因检测等领域发挥重要作用。
扩增子建库技术路线
1、标准扩增子建库流程
图1. 标准扩增子建库流程。
标准扩增子建库流程为在完整模板的基础上投入多重扩增的Panel进行多重扩增，随后将得到的扩增子进行引物消化，消化掉多余的引物二聚体以及两端引物本身的部分序列，获得平末端的结构，与接头连接后形成完整文库。
2、两步法扩增子建库流程
图2. 两步法扩增子建库流程。
两轮扩增的方法原理是在基因组基础上，投入的多重扩增的引物带有一定的修饰，经过第一轮多重扩增之后，序列两端带有一段接头序列，第二轮扩增将Index添加上去，经过两轮扩增形成完整文库。
3、多重PCR产物扩增子建库流程
图3. 多重PCR产物扩增子建库流程。
多重PCR产物扩增子建库原理是在待测基因组上投入无修饰的多重扩增引物进行多重PCR，产物经过纯化后，进行常规DNA建库。
