流式细胞术确定基因的存在，系统性定制人源化受体

流式细胞术确定基因的存在，系统性定制人源化受体根据上述SNIPRs的ECD测试实验发现，Notch1的TMD和JMD可以适配各种ECDs，那么它们到底有什么特征可以兼容这些ECDs？有没有其他TMD和JMD也可以行使这种功能？为此，研究人员们从人源蛋白中筛选了88个TMDs和76个JMDs，依次将它们单独插入和替换到synNotch的框架中，并分析了那些活性高于synNotch的50%的TMD和JMD的序列，试图寻找其中的相似性。对于TMDs的研究表明，活性较高的TMDs大部分来源于Notch和calsyntenin（CLSTN）家族，序列对比发现它们在C末端都拥有与γ分泌酶切割相关的甘氨酸-缬氨酸基序，并且突变这个基序会影响受体的活性。另一方面，对于JMDs的研究发现，活性较高的JMDs序列倾向于在紧接着穿膜序列的后面跟着碱性氨基酸，前四到六个氨基酸由碱性或极性氨基酸构成，另外，前3个氨基酸中至少有两个精氨酸或赖氨酸。而含有酸性或者

撰文 | 寒冰

责编 | 兮

细胞的正常运作离不开细胞信号的传导。来自外界或内部的信号分子通过被细胞上对应的受体识别和结合，从而使细胞做出相应的回应，比如基因调控等等，来适应外界或内部的环境。利用这种自然规律，在过去的几十年里，合成生物学家们将天然的受体进行工程化改造，使其可以识别指定的信号分子并产生定制的下游通路【1】，这种精准操控的方法为细胞疗法带来了曙光，这其中就包括合成的Notch（synNotch）受体【2 3】。

synNotch同Notch一样是通过调节性膜内蛋白水解（regulated intramembrane proteolysis，RIP）来激活的受体，这一过程依次包括ADAM蛋白酶介导的细胞外结构域 (ECD) 的脱落，γ分泌酶介导的跨膜结构域（TMD）的切割，以及转录因子的释放和对应的基因调控【2 4】。但不同于Notch，synNotch识别指定的抗原（如单链抗体（scFv）等），并释放工程化的转录因子诱导指定的基因表达【2】。其在细胞疗法中应用的例子可参考之前BioArt的解读文章“Science丨对靶细胞精确制导！合成生物学助力编程目标受体和细胞因子”。尽管synNotch在细胞工程方面战果累累，但它仍然存在一些限制因素，这些缺陷阻碍了它在未来向临床医学的转化。这些问题包括：1. 采用非人源化的组分可能会引起人体的免疫排斥；2. 缺乏系统性模块化构建受体的法则；3. 表达的受体分子过大，不易被激活，较高的背景信号，以及不相容的转录因子。

为了构建一个更好的受体平台，近日，来自加州大学旧金山分校的Kole T.Roybal（之前发明synNotch的第一作者【2 3】）课题组在Cell上在线发表文章Modular design of synthetic receptors for programmed gene regulation in cell therapies。作者们将合成受体拆分成细胞外结构域（ECD），跨膜区域（TMD），细胞内近膜结构域（JMD）以及转录因子（TF）几个模块，并针对每个模块进行系统性优化，从人源的天然受体或转录因子中进行最优化的改造合并组装，合成了一组新的名为合成膜内蛋白水解受体SNIPRs（synthetic intramembrane proteolysis receptors）。SNIPRs相比于之前的synNotch表达更好，蛋白更小，易于调节，完全人源化，并对目标配体的灵敏度和特异性更强，与嵌合抗原受体修饰T细胞（Chimeric antigen receptor modified T cells CAR-T cells）配合使用更精准靶向癌细胞，为向临床转化的细胞疗法改造提供了新的强有力的工具。

搭建一个好的合成受体好比组装一部优秀的四驱赛车，马达，齿轮，轴承和轮胎，每一个部分都需要优化改造才能取得最好的性能。起初研究人员们还是延续之前synNotch的设计思路，找到了另一个人源RIP受体Robo1并改造成synRobo1。然而受体却很难被激活， 但是将JMD和TMD换成人源Notch1的这部分就可以提高synRobo1的活性。另外去除Robo1的ECD上的ADAM10酶切位点可以有效降低组成型活性，说明ECD中的酶切位点虽然不会对受体的功能造成影响，但却可以调控受体的活性。经过以上的尝试，接下来研究人员们决定从头开始，系统性的将SNIPR划分成四大模块ECD，TMD，JMD和TF（图1），然后从ECD开始依次进行改造。

图1 SNIPRs设计流程和思路

针对ECD的改造，作者们保留之前Notch1的TMD和JMD，测试了三大类ECD：包含有蛋白酶切位点的合成肽段，Notch派生出来的结构域，和来源于CARs的铰链结构域（比如CD8α和CD28）。研究发现：1. SNIPRs的活性受ECD脱落的影响，而ECD的脱落依赖于蛋白酶的可得性以及酶切位点的可及性；2. 敲除Notch1的NRR（negative regulatory region）结构域表现出更强的配体诱导的激活反应但同时也可被T细胞活化激活（“或”门），另一方面T细胞活化可以增强synNotch的受体活性（“与”门）；3. 拥有铰链结构域的SNIPRs表达水平更高，激活水平更强，而携带27个氨基酸长度的CD8α铰链结构域的ECD更是表现出高表达，高活性，高信噪比并且表达的蛋白更小的特点。综上，作者们决定采用改造过的CD8α铰链结构域作为SNIPRs的ECD。

根据上述SNIPRs的ECD测试实验发现，Notch1的TMD和JMD可以适配各种ECDs，那么它们到底有什么特征可以兼容这些ECDs？有没有其他TMD和JMD也可以行使这种功能？为此，研究人员们从人源蛋白中筛选了88个TMDs和76个JMDs，依次将它们单独插入和替换到synNotch的框架中，并分析了那些活性高于synNotch的50%的TMD和JMD的序列，试图寻找其中的相似性。对于TMDs的研究表明，活性较高的TMDs大部分来源于Notch和calsyntenin（CLSTN）家族，序列对比发现它们在C末端都拥有与γ分泌酶切割相关的甘氨酸-缬氨酸基序，并且突变这个基序会影响受体的活性。另一方面，对于JMDs的研究发现，活性较高的JMDs序列倾向于在紧接着穿膜序列的后面跟着碱性氨基酸，前四到六个氨基酸由碱性或极性氨基酸构成，另外，前3个氨基酸中至少有两个精氨酸或赖氨酸。而含有酸性或者疏水的氨基酸的JMDs会抑制受体的活性。值得注意的是，将SNIPR中Notch1的TMD和JMD替换成CLSTN2的TMD和AGER或者PTPFR的JMD可以获得更好的受体活性，说明这种模块化组装方法可以灵活的调整受体的传感与活性。

至此，SNIPRs的前三个模块已经梳理清楚并可以行使正常的功能，接下来研究人员们根据蛋白表达，依赖和非依赖于配体激活的程度，从每个模块的菜单上选择其中的最优解并组装。首先，ECD是改造过的CD8α铰链结构域，TMD继续沿用Notch1的部分，JMD则选择来自Notch1或Notch2的JMD，与配体相结合的区域（LBD）则可以进行定制，最终只剩下非人源化的TF需要置换。研究人员们将包含DNA结合域（DBD）的TF融合在人源NF-κB p65的反式激活结构域（TAD）上，并检验了来自人源蛋白的DBDs（Pax6和HNF1A）和工程化的正交合成锌指蛋白（synTFs）（ZF6和ZF10）在SNIPRs情景下的功能。人源化的SNIPRs被激活，但激活的基因表达因TF而变，这说明SNIPRs在细胞内的功能受到不同TF的转录激活方面的效率影响。值得注意的是，基于Pax6和HNF1A的SNIPRs包含的预测的有免疫原性的肽段序列与目前临床设计的CAR预测出来的相似，这一点大大降低了SNIPRs在临床治疗中的排斥风险。总之，SNIPRs可以与广泛的TF兼容，突破了临床转化的主要障碍。以上，SNIPRs的平台终于搭建成功，只差在体内与CARs并肩作战面对最终的肿瘤boss。

当前CAR免疫疗法面临的主要困境是难以用单一的抗原来定义肿瘤，但当它有了人源化SNIPR这个小伙伴时，抗原选择就多了一个。根据作者们最近的报道，ALPPL2作为一种肿瘤特异性抗原可以分别与间皮瘤中的肿瘤相关抗原间皮素或卵巢癌中的HER2 共同靶向治疗【5】。于是，研究人员们将SNIPR定制成识别ALPPL2蛋白的受体，而CAR是经过SNIPRs激活后转录调控产生的，对HER2抗原进行响应，即形成anti-ALPPL2 SNIPR——>anti-HER2 CAR回路。体外和体内的肿瘤实验结果表明SNIPR——> CAR回路可以特异性清除双抗原肿瘤细胞，但不能清除单HER2抗原肿瘤细胞。

总的来说，该研究系统性的构建了一类可自主定制的人源化受体，其详细的分析为未来更精准的细胞疗法提供了一个全面的工具包。有意思的是，在今年1月20号，Nature Chemical Biology上发表了一篇观点文章，题为The evolution of synthetic receptor systems。其中介绍了目前开发出来的哺乳动物系统的合成受体（图2），并且提到了本文中的SNIPR。此外，文章作者更提出了一种通用的受体系统改进策略，使其能够满足规定的功能，称为“合成受体工程的度量方法（MEASRE）”，感兴趣的朋友可以阅读一下。

图2哺乳动物合成受体工具包

原文地址：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.03.023

制版人：十一

参考文献

1. Manhas J Edelstein H I Leonard J N et al. The evolution of synthetic receptor systems. Nature Chemical Biology 2022: 1-12.

2. Morsut L Roybal K T Xiong X et al. Engineering customized cell sensing and response behaviors using synthetic notch receptors. Cell 2016 164(4): 780-791.

3. Roybal K T Williams J Z Morsut L et al. Engineering T cells with customized therapeutic response programs using synthetic notch receptors. Cell 2016 167(2): 419-432. e16.

4. Kopan R Ilagan M X G. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell 2009 137(2): 216-233.

5. Hyrenius-Wittsten A Su Y Park M et al. SynNotch CAR circuits enhance solid tumor recognition and promote persistent antitumor activity in mouse models. Science translational medicine 2021 13(591): eabd8836.

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