为什么氧还原催化剂最好的是铂？用于共轭还原和还原胺化的多功能生物催化剂

为什么氧还原催化剂最好的是铂？用于共轭还原和还原胺化的多功能生物催化剂作者利用优化后的反应条件探索了EneIRED的底物范围(图2)。EneIRED具有较宽的底物范围，可产生CR和单-RA产物。一般情况下，不受阻碍的烯酮和烯酮能以高化学选择性转化为相应的饱和胺。通过比较阻碍度增大的2-取代的2-烯醛化合物3-5和阻碍度减小的胺给体化合物a-c与肉桂醛化合物6的反应谱图，作者发现了这种趋势。图1烟酰胺依赖的酶是不对称共轭还原(CR)和RA的通用生物催化剂。对于RA，亚胺还原酶(IREDs)因其具有广阔的底物范围和可用于工业应用而成为具有吸引力的催化剂。IREDs具有化学选择性还原C=N键的特点，尽管在特殊情况下它们可以还原活性碳基的C=O键。此外，作者最近证明了IREDs可以与烯还原酶(EREDs)在一锅过程中结合，以还原环α、β不饱和亚胺(烯-亚胺)的C=C和C=N键。作者推测，如果IRED能够以类似于最近报道的生物合成氧化还原酶的方式催化这两个步骤，这种生

用于共轭还原和还原胺化的多功能生物催化剂

文章出处：Thomas W. Thorpe James R. Marshall Vanessa Harawa Rebecca E. Ruscoe Anibal Cuetos James D. Finnigan Antonio Angelastro Rachel S. Heath Fabio Parmeggiani Simon J. Charnock Roger M. Howard Rajesh Kumar David S. B. Daniels Gideon Grogan Nicholas J. Turner. Multifunctional biocatalyst for conjugate reduction and reductive amination. Nature 2022 604 86-91.

摘要：手性胺非对映体普遍存在于医药和农用化学品中，但其制备往往依赖于低效率的多步合成。这些有价值的化合物必须是不对称合成的，因为它们的生化特性会因分子的手性而有所不同。在这里，作者描述了一种多功能的胺合成生物催化剂，据作者所知，它使用的机制是以前没有报道过的。该酶(EneIRED)是在宏基因组亚胺还原酶(IRED)中鉴定出来的，来源于一种未分类的假单胞菌，具有不同寻常的活性位点结构，可以促进胺活化共轭烯烃还原，然后再进行还原胺化。该酶可将多种α、β不饱和羰基与胺偶联，有效合成三个立体中心以上的手性胺对映体。机理和结构研究已经展开，以描述EneIRED催化的单个步骤的顺序，这导致了对整个催化循环的建议。这项工作表明，IRED家族可以作为一个平台，促进进一步发现酶活性，并应用于合成生物学和有机合成。

还原性胺化(RA)是药物化学中应用最广泛、最有效的合成高值手性胺的方法之一，通过羰基和胺的还原偶联可以有效地生成C-N键。不对称RA的有效催化剂的开发仍在继续，包括基于金属、有机和生物催化的催化剂。此外，有价值的含氨基化合物通常包含多个立体中心(图1a)，尽管对其手性的全面控制更具挑战性，但会导致效率较低的多步骤合成或更复杂的串联催化系统。尽管多酶系统对这些仿生串联过程具有很高的适应性(图1b)，但它们的组装困难来自于反应介质和反应速率的不兼容性，这可能导致副产物的形成和复杂的反应设置。为了解决这些问题并达到预期的反应指标，通常需要对每个酶组分进行大量的蛋白质工程。发现一种可以通过类似RA的过程控制多个立体中心的单一酶将是非常理想的，并能够使用一锅一催化剂系统高效合成有价值的胺的对映体(图1c)。

烟酰胺依赖的酶是不对称共轭还原(CR)和RA的通用生物催化剂。对于RA，亚胺还原酶(IREDs)因其具有广阔的底物范围和可用于工业应用而成为具有吸引力的催化剂。IREDs具有化学选择性还原C=N键的特点，尽管在特殊情况下它们可以还原活性碳基的C=O键。此外，作者最近证明了IREDs可以与烯还原酶(EREDs)在一锅过程中结合，以还原环α、β不饱和亚胺(烯-亚胺)的C=C和C=N键。作者推测，如果IRED能够以类似于最近报道的生物合成氧化还原酶的方式催化这两个步骤，这种生物催化剂可以应用于α、β不饱和羰基的CR-RA，并允许获得对映体丰富的胺的对映体(图1c)。

在追求这一活性的过程中，作者筛选了已报道的和作者最近建立的(元)基因组IREDs，用于将环烯亚胺I完全还原为胺II (图1d)。在筛选出的389个IREDs中，作者观测到262种酶催化I的还原，且大多数为常规行为，即仅还原C=N键(206种酶，53%)。一小部分IREDs能够催化I的C=C和C=N键还原到对映体富集产物II上(44种酶，11%)。此外，在互补的方式下，一些IREDs单独还原C=C键(12种酶，3%)。根据遗传序列绘制反应谱图，仅表明局部序列与活性相关。一种宏基因组酶，可能来自于一种未分类的假单胞菌(EneIRED，图1d)，表现出极好的I到II的完全还原，因此选择该酶进行进一步研究。

EneIRED检测了烯丙基胺化合物a催化环己二烯酮化合物1的CR-RA的能力，监测潜在的还原和偶联产物1a、1’、1’a包括氮杂合共轭加成。反应以高转化率进行，以CR-RA产物1’a和CR产物1’为主，无RA直接产物1a伴生。优化缓冲液类型、pH值和共溶剂后，提高了用1.1倍当量的烯丙基胺转化到1'a的转化率(61%)，并且可以用20倍当量的化合物a进行放大，相应的盐酸盐的产率为69% (图1e)。

图1

作者利用优化后的反应条件探索了EneIRED的底物范围(图2)。EneIRED具有较宽的底物范围，可产生CR和单-RA产物。一般情况下，不受阻碍的烯酮和烯酮能以高化学选择性转化为相应的饱和胺。通过比较阻碍度增大的2-取代的2-烯醛化合物3-5和阻碍度减小的胺给体化合物a-c与肉桂醛化合物6的反应谱图，作者发现了这种趋势。

不同环尺寸的环烯酮，如具有6-和5-元的化合物1和10，均被EneIRED所接受，可以很好地转化为相应的饱和胺产物1’b或10’b，而不具有直接的RA产物1b或10b。2-、3-和4-4’-甲基取代环烷基-2-烯酮化合物12-15也被酶接受，其中3-取代的化合物12和15对相应的CR-RA产物12’b和15’b具有较高的转化率、化学选择性和立体选择性。环己基2-烯酮骨架的化合物15-22的C-3取代耐受良好，对相应的N-取代环己胺15’b、16’b、18’b和20’b具有良好的转化、化学、对映体和对映体选择性。以3-甲基环己酮化合物15为底物，探索了广泛选择的胺类配合物。对小的线性伯胺化合物a-c、e-h有良好的转化、化学和对映选择性。值得注意的是，胺化合物a、e、g、h可以有效地形成功能化产物，仲胺吡咯烷化合物i也可以。

作者也很想知道是否可以合成具有额外立体中心的CR-RA产品。(R)-或(S)-3-氟吡啶化合物j可与3-甲基环己酮化合物15有效偶联，使化合物(cis)-15’j具有高的化学和对映选择性。此外，环丙胺化合物b与外消旋烯酮化合物23的CR-RA反应表明，单催化剂可以控制环己胺环化合物23’b上的3个立体中心，具有良好的化学和对映选择性。

为了评价EneIRED催化CR-RA合成的适用性，采用制备级合成法，分别以化合物15与化合物a、b或i配合的，以及化合物16与化合物b配合的形成15’a、15’b、15’i和16’b的盐酸盐为单体，分离产率分别为81%、77%、60%和72%。前一个例子可以增加到50 mM的烯酮化合物15和250 mM (5倍当量)的胺化合物b的底物负载，在1.0 mmol (110 mg，TTN = 640)的条件下，以64%的分离产率得到化合物15’b。

图2

接下来，作者进行了机理研究，以进一步表征EneIRED，并识别CR-RA过程中形成的任何中间体。EneIRED仅使用还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH) (2倍当量)有效催化了反应。此外，在没有EneIRED或烟酰胺共底物再生系统的情况下，没有检测到还原产物。同位素标记实验，使用原位生成的氘化烟酰胺共底物D-葡萄糖-1-d1，在不饱和羰基底物C-1和C-3发生氢化物转移时，从化合物15和b得到化合物1 3-d2-15’b (图3a，75%的分离产率，91%的二维掺入)。

时间-过程研究符合CR-RA双氢化物分步转移机理，即烯酮化合物15先经历CR到中间对映体富集酮化合物(R)-15’，然后再经历中间产物RA到最终产物(1R 3R)-15’b。重要的是，在时间过程中没有观测到RA的直接产物15b (一种潜在的替代中间体)，这表明该反应仅通过酮混合15’进行。此外，虽然化合物15b对EneIRED和共底物的氧化还原活性是惰性的，但酮化合物(R)-15’与b发生了RA反应，表明化合物15’是唯一的反应中间体。

作者也热衷于探索在CR步骤中形成的酶-底物复合物。在反应中忽略任何胺给体都不会产生CR或RA的产物(图3b)，这表明IRED催化反应明显需要在催化循环中存在胺。此外，当烯酮化合物15与叔胺供体三乙胺化合物k或不饱和酯甲基环己基-1-烯-1-羧酸酯和环丙胺化合物b结合时，均未观测到活性，这表明EneIRED催化CR可能是通过一个烯-亚胺NAD(P)H生物催化剂复合物发生的，类似于最近在人工酶中存在的有机催化CR体系。据作者所知，这是第一个通过这种烯亚胺中间体达到CR的酶的例子。

EneIRED的多种活性促使作者使用X射线晶体学研究其结构。与NADP 配合物的EneIRED晶体是在P21空间群中获得的，在不对称单元中有两个分子，形成了现在IRED族中观测到的熟悉的域交换二聚体折叠(图3c)。使用DALI服务器将该单体结构与蛋白质数据库中的其它结构进行比较，发现数据库中最接近的IRED结构是来自于Streptosporangium roseum (5OCM，30%，1.6 Å)、Aspergillus oryzae (5G6S，30%，1.6 Å)和Stackebrandtia nassauensis (6JIT，30%，2.0 Å)。与数据库中其它具有结构IRED相比，最显著的差异是在活性位点观测到的(图3f)。

EneIRED具有一个酪氨酸残基Y177，如图所示，位于活性位点顶部，与其它IRED一样，例如Streptomyces sp. GF3546 (4OQY)、Bacillus cereus (4D3F)和Nocardopsis halophila (4D3S)，对模型亚胺化合物2-甲基吡咯啉的还原表现出(S)-立体选择性。与这些酶一样，Y177与侧链上的羟基形成氢键，在本例中是苏氨酸T101，它反过来又与NADP 中核糖的2’-羟基形成氢键。然而，EneIRED还具有一个额外的酪氨酸残基Y181，它也指向共底物结合间隙的活性位点，在5OCM和6JIT中都是一个疏水亮氨酸。活性位点还含有大量环状疏水氨基酸侧链F185、Y269、H245和A240 Y129位于后方，V244位于前方，这些形成了一个封闭的空腔，之前已经观测到适合的结合，特别是平面环状亚胺在IRED结构。

作者通过EneIRED的点变体来探索Y177和Y181在CR-RA中的作用。Y181的点突变(EneIRED-Y181A/L/F)使突变体对化合物15和b的CR-RA反应表现出较低的立体选择性(图3e)。这表明，在CR和RA步骤中，该位置对于控制氢化物传递面的空间约束是很重要的。与野生型相比，EneIRED-Y181A和Y177点突变EneIRED-Y177A均表现出显著的CR-RA速率降低，即化合物15’b消耗速率和化合物15’b积累速率均较低。有趣的是，对于Y177A，在反应过程中只观测到低水平的酮(< 5%)，这表明这种残留物对CR重要而对RA不重要。

利用AutoDock Vina构建了化合物15与b缩合形成的烯亚胺复合物的酶活性位点模型(图3f)。在上位，模型表明，离共底物的吡啶环C-4最近的适合于氢化物接受的原子是C=C键的前手性碳原子。如模型所示，将氢化物输送到这个原子会在这个中心得到实验观测到的(R)-构型。

图3

在作者的结构和机理研究的基础上，提出了以下双EneIRED催化循环用于生产CR-RA (图4a)。首先，烟酰胺共底物和α、β不饱和羰基化合物V与胺的缩合产物形成活性位点烯-亚胺NAD(P)H-EneIRED配合物VI。当底物取向动力学上倾向于向烟酰胺氢化物取向的烯亚胺的C-3时，CR生成立体富集的1-烯胺NAD(P) -EneIRED配合物VII。随后，氧化的共底物和前手性1-烯胺被逐出酶，后者在溶液中水解形成立体富集羰基化合物VIII。进一步的NAD(P)H共底物与先前释放的羰基VIII和胺的缩合产物结合在酶上，形成复合物IX，该复合物经历预期的IRED催化的RA，产生立体富集的最终产物X。

最后，最终在试图通过共轭二烯酮进一步扩展酶催化CR-RA。而化合物24易受氮杂合偶联加成的影响，EneIRED催化α，β，γ，δ-不饱和烯酮化合物24的四电子和六电子CR-RA与环丙胺化合物b结合，分别得到化合物24’b和化合物(trans)-24’’b=16’b (图4b)。有趣的是，六电子的CR-RA产物24’’b=16’b与相应的乙基取代α，β不饱和烯酮化合物16的CR-RA具有相似的对映选择性，说明化合物24的还原过程与化合物16的还原过程相似。该实验表明EneIRED可用于建立CR-RA过程中额外的立体中心。

图4

总之，作者报道了一种多功能生物催化剂(EneIRED)的表征，该催化剂能够催化CR、亚胺还原和RA。EneIRED具有广阔的底物范围，可以从简单的前手性起始物质开始，在一锅一催化剂的反应中立体选择性制备有价值的胺的对映体。机理和结构研究揭示了EneIRED首先通过烯-亚胺NAD(P)H酶复合物催化胺活化α，β不饱和羰基CR的多步骤过程，据作者所知，这是以前没有描述过的。作者设想，通过酶工程对生物催化剂的细化将减少权宜CR-RA的胺负荷，并扩大底物范围。该反应进一步扩展了IREDs反应的功能，并强调了其在立体化学定义的手性胺合成中的重要性。