大规模细胞培养方法：你所不知道的3D细胞培养

大规模细胞培养方法：你所不知道的3D细胞培养3D细胞培养方式✦ 使用少量细胞数，实现快速生长，兼容自动化仪器，降低成本✦ 在体外模拟复杂的组织结构和体内形态，接近体内正常细胞生长环境✦ 展示分化等细胞活动和细胞间反应，实现真实的细胞生物学和功能✦ 准确建立靶组织模型，有效预测病程和药物反应

新的学期即将到来，实验室也将迎来一批新同学，每个实验室都有自己的技术传承，师兄师姐会将实验技巧传授给新来的小师弟师妹。让我们来看看发生在“N”大学实验室内的一组对话吧～

3D细胞培养定义

3D细胞培养是一种在人工创造的环境中生物细胞可以在所有三维空间中生长的技术，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞载体复合物，3D细胞培养允许细胞在体外向各个方向生长，类似于它们在体内的生长方式。3D培养技术既能保留体内细胞微环境的物质及结构基础，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。

3D细胞培养优势

✦ 在体外模拟复杂的组织结构和体内形态，接近体内正常细胞生长环境

✦ 展示分化等细胞活动和细胞间反应，实现真实的细胞生物学和功能

✦ 准确建立靶组织模型，有效预测病程和药物反应

✦ 使用少量细胞数，实现快速生长，兼容自动化仪器，降低成本

3D细胞培养方式

理想的3D培养模型可以模拟组织特异性或特定于生理、病理生理疾病微在该环境中细胞可以实现增殖，分化。这种模型将包括细胞与细胞，细胞与细胞外基质的相互作用，组织特异性硬度，氧，营养和代谢废物梯度，以及它们的组合组织特异性支架细胞。

01、无支架培养方式

无支架3D培养方法依赖于自聚集专门培养板中的细胞，如悬滴微孔板，具有超低附着的低粘附力板促进球体形成和微流控芯片允许微流体细胞培养的平板。球状体特别是多细胞球体，概述关于细胞间接触的组织和肿瘤的生理特征，如果合成他们自己的细胞外基质，允许自然细胞基质互动。球体的大小取决于细胞的初始数量种子和球状体可以生长到它们显示的尺寸，类似于组织的氧和营养梯度。

悬滴法是常见的一种3D细胞培养法，表面不能附着，利用细胞自聚集成球状体，吊滴可以在带有开放式无底孔的专用板中创建小液滴。当液滴足够大，可以使细胞悬浮在培养基中，液滴小利于实验操作。在悬垂滴板中培养几天细胞可以实现肿瘤细胞的微环境，形成几层，由氧、营养物质、PH和代谢废物能够成为梯度进入或送出。

低吸附力球形培养板，半球形的底部结构减少细胞附着面积，更利于细胞自发聚集成球，可以直接在球形板中扩大细胞生长，不需要转板。使用96孔或384孔板培养细胞的起始量更多。球形板降低细胞附着，利用成球，因为培养的体积较大，可以培养的细胞数更多，适用于肿瘤细胞研究。

磁悬浮法是一种新型的3D细胞培养方法，是利用磁性的吸引来形成球形细胞，细胞预装磁性纳米粒子，在外部施加的磁场朝着空气或液体漂浮的低吸附板的界面来促进细胞的聚集和球形的形成。此方法常用来在各种组织细胞中产生球体，形成多细胞间充质干细胞球体。

02、有支架培养方式

基于脚手架的培养技术可提供物理支持，从简单的机械结构到类似细胞外间质类似物，细胞可以在支架上聚集，增殖和迁移。基于支架的3D培养中，细胞被嵌入到基质中，基质的物理化学性质会影响细胞的特性。支架可以是天然的也可以是人工合成的，注意粘合性、硬度和负载能力。在一些支架中，生长因子，激素或其他生物活性分子可以被嵌入来增强细胞增殖或促进特定的细胞表型。因此，在一些特定用途上的3D细胞培养选择支架时要考虑材料的特性和物理因素，如培养物中的孔隙率，刚度和稳定性，生物学特性如细胞相容性或粘附性。硬质聚合物可以提供在专门组织中发现的物理支持，例如皮肤，肌腱或骨骼等。

天然来源的水凝胶，被广泛用于体外3D细胞培养应用。水凝胶是由交联的多聚链或复杂的天然或合成蛋白分子组成的网络构成。由于含大量水，水凝胶具有和天然组织非常相似的生物物理学特性，因而可以作为高效的3D细胞培养基质。水凝胶可以单独或和其他技术（如固体支架、可通透支持物、细胞微阵列和微流体设备）联用。在3D培养系统中水凝胶有多种使用方法：包括为固体支架在内的多种细胞培养表面做包被，也可以将细胞包裹或夹在基质中间。水凝胶基质中细胞的形态、生长和功能取决于生物物理学和生物化学特性，以及如通透性和基质硬度在内的物理特性。

天然来源的细胞培养水凝胶通常由蛋白和ECM成分（如胶原、层纤连蛋白、纤维蛋白、透明质酸、壳聚糖等）构成。由于来源于天然成分，存在多种有助于多种细胞存活、增殖、功能实现和发育的内源因子，这些凝胶本身具有生物兼容性和生物活性，有利于细胞功能的完成。

经过精心设计的合成水凝胶可用作3D细胞培养支架，因其可以模仿生物ECM的特性，可以通过粘合来界定功能位点，如蛋白水解位点和嵌入生长因素，以其清晰的化学和物理特性，具有可调的机械性能和所需的刚度或孔隙率。合成水凝胶可以分为非天然和天然聚合物，聚乙二醇（PEG），聚乳酸（PA），聚乙醇酸（PGA）和其他非天然聚合物水凝胶具有比较便宜，相对惰性，可重现的材料特性，通过合成或交联易于调整结构，并且是可复制的，可以获得一致的结果。然而，非天然聚合物缺乏粘合部分在天然ECM中需要生物肽交联脚手架以改善功能。PEG凝胶及其衍生物已用于多种3D细胞培养应用，包括干细胞分化，细胞侵袭和血管生成。

3D细胞培养设计支架需要考虑的重要问题就是支架内部结构的尺度和局部解剖结构。体内的ECM提供着支撑细胞的错综复杂的纳米级基础结构，指导性地控制着细胞的行为。结合在微尺度结构支架上的细胞会像培养在扁平表面一样变平并扩散。细胞环境的地貌即便发生了细微的纳米级变化也会导致不同的细胞行为。除了大小和结构，用于构建的材料、表面化学特性、基质硬度、通透性和机械力都会对细胞粘附、生长和行为产生显著的影响。

目前，合成硬的支架和微模型微孔板常应用于组织再生重建骨骼，韧带和软骨天然物理和环境结构，用于皮肤，血管，骨骼肌或中枢神经系统组织以及用于临床前体外3D肿瘤或工程组织的培养测试。微流体设备专为3D细胞培养设备，在输送并稳定氧气和营养物质供应的同时可以清除代谢废物做好应用。微流体装置可以模拟细胞中体内发现的剪切力，像内皮细胞一样暴露在血流中，作为模仿ECM的支撑基质。微流体装置可以支持持续使用药物或可溶性小分子，比如在不同类型的和不同隔间之间细胞进行生长因子或流体交换。

3D细胞培养应用领域

1. 高通量药物筛选实验

2. 肿瘤球体检测

3. 器官再生研究

4. 宿主和病原体之间感染模型的研究

5. 胚胎干细胞（ES）细胞和诱导式多能性

6. 干细胞（iPS）细胞的扩张和分化