用什么诱导青霉过氧化氢酶的活性（Biology米黑根霉L-天冬酰胺酶的异源表达及合理设计以提高热稳定性）

用什么诱导青霉过氧化氢酶的活性（Biology米黑根霉L-天冬酰胺酶的异源表达及合理设计以提高热稳定性）为了提高L-天冬酰胺酶的活性和热稳定性，作者以豚鼠L-天冬酰胺酶的晶体结构(PDB代码：4R8L)为模板，构建了基于米黑根霉L-天冬酰胺酶(RmAsnase)氨基酸序列的三维模型结构(图2)。通常情况下，对酶的柔性氨基酸残基进行修饰可以提高热稳定性。同时，催化三元组5Å内的柔性位点对催化活性有显着影响。因此，在避开活性中心后，作者用FoldX对剩余的柔性氨基酸残基进行了模拟。蛋白质展开自由能∆G是蛋白质的重要热力学参数。使用生物信息学软件FoldX模拟氨基酸突变对∆G的影响。具体地，估计特定RmAsnase突变前后的∆G值，并用于计算相应的展开自由能变化，∆∆G=∆G突变体−∆G野生型。在本研究中，作者分别从黄曲霉(1338bp) 杰丁塞伯林德纳氏酵母(771bp) 和米黑根霉(2043bp)中成功克隆和扩增了L-天冬酰胺酶基因(Afans、Cjans和Rmans)。将克隆的基因克隆到pE

今天推送的文章是2021年12月发表在Biology上的

“Heterologous Expression and Rational Design of L-asparaginase

from Rhizomucor miehei to Improve Thermostability”

，通讯作者是来自江南大学生物工程学院的饶志明教授。

L-天冬酰胺酶(EC 3.5.1.1)是一种酰胺水解酶，催化L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸和氨。L-天冬酰胺酶广泛分布于自然界，并已在植物、动物和微生物中被鉴定。微生物，包括细菌、酵母和丝状真菌，是食品生产和其他应用中L-天冬酰胺酶的理想来源，因为它们的培养成本相对较低，并且可以方便地优化生产和纯化工艺。此外，从这些来源分离的酶比从植物或动物中提取的酶相对更稳定。

从大肠杆菌或菊欧文氏菌获得的L-天冬酰胺酶制剂已广泛应用于食品和保健行业。在食品工业中，L-天冬酰胺酶主要用于食品预处理过程中，以去除丙烯酰胺的前体L-天冬酰胺。但预处理条件差异显著。因此，由于传统L-天冬酰胺酶制剂的热稳定性差和底物特异性有限，这些应用受到了食品和医疗保健行业中常见的复杂环境的阻碍。

在前期研究中，作者以大肠杆菌为宿主菌，对嗜热嗜压古菌Pyrococcus yayanosii CH1和枯草芽孢杆菌的L-天冬酰胺酶进行了异源表达，并对其酶学性质进行了分析，并采用合理的设计原则对其进行了修饰。但枯草芽孢杆菌L-天冬酰胺酶比活力仅为92.45U·mg⁻¹，而P. yayanosii CH1 L-天冬酰胺酶的最适温度为95◦C，均不适合工业应用。因此，筛选和挖掘更合适的L-天冬酰胺酶具有重要的工业和食品应用价值。为了在突变体库中通过合理设计获得稳定的L-天冬酰胺酶，应用计算设计软件(FoldX5)结合保守性分析和功能区评估来预测潜在的稳定点突变。在枯草芽孢杆菌168细胞内过表达效果最好。用分子动力学模拟阐明了稳定性增强的机理。最终获得了一株酶活力高、稳定性好的组合突变体。

在本研究中，作者分别从黄曲霉(1338bp) 杰丁塞伯林德纳氏酵母(771bp) 和米黑根霉(2043bp)中成功克隆和扩增了L-天冬酰胺酶基因(Afans、Cjans和Rmans)。将克隆的基因克隆到pET-28a质粒中，转化大肠杆菌BL21进行表达，成功构建了L-天冬酰胺酶重组菌株E.coli BL21/pET28a-Afans、E.coli BL21/pET28a-Cjans和E.coli BL21/pET28a-Rmans。SDS-PAGE分析表明，编码49.5 kDa蛋白的Afans基因和编码28.5 kDa蛋白的Cjans基因在大肠杆菌中以包涵体形式表达，而编码75 kDa蛋白的RMAN基因在大肠杆菌中能够正常表达。对粗酶液进行酶活力测定。结果表明，大肠杆菌BL21/pET28a-Afans和大肠杆菌BL21/pET28a-Cjans菌株均不具有L-天冬酰胺酶活性，而大肠杆菌BL21/pET28a-Rmans菌株的L-天冬酰胺酶活力约为4.1U·mL⁻¹。

为了提高L-天冬酰胺酶的活性和热稳定性，作者以豚鼠L-天冬酰胺酶的晶体结构(PDB代码：4R8L)为模板，构建了基于米黑根霉L-天冬酰胺酶(RmAsnase)氨基酸序列的三维模型结构(图2)。通常情况下，对酶的柔性氨基酸残基进行修饰可以提高热稳定性。同时，催化三元组5Å内的柔性位点对催化活性有显着影响。因此，在避开活性中心后，作者用FoldX对剩余的柔性氨基酸残基进行了模拟。蛋白质展开自由能∆G是蛋白质的重要热力学参数。使用生物信息学软件FoldX模拟氨基酸突变对∆G的影响。具体地，估计特定RmAsnase突变前后的∆G值，并用于计算相应的展开自由能变化，∆∆G=∆G突变体−∆G野生型。

图2.RmAsnase的三维结构。不同的颜色表示 RmAsnase 四聚体的四个亚基，球体突出显示了酶活性位点（绿色）和突变位点（红色）。

假设特定突变的∆∆G值小于零。这表明这种突变提高了酶的热稳定性，负值越多，稳定性越高。相反，大于零的∆∆G值表明这种突变对酶的稳定性有害。突变体S302M、S302L、D161M、D184M、S302I、E217M、E217P、E217R和S302V是根据∆∆G从最小到最大的顺序构建的(表1)。此外，利用PYMOL软件检测了RmAsnase三维空间结构中相应位点的位置，避开了酶的活性中心。在作者以前的研究中，作者发现当A344位点发生突变时，酶的活性可以大大提高。因此，作者引入A344E作为突变位点，获得了一个高活性的突变体。

表1

作者分析了重组L-天冬酰胺酶突变体的酶活性。与野生型酶相比，突变体A344E、S302I和S302M的特异酶活性分别提高了55%、32%和28%（表2）。作者对这些活性显著增加的突变体进行了进一步的酶学性质分析。

表2

在不同温度下测量野生型和突变型酶的特定酶活性（图3a）。作者将测得的野生型酶和每个突变体的最大酶活性设置为100%，以研究最适温度是否发生变化。重组野生型酶的最适温度为45℃、而A344E突变体的温度已经移到了40℃，在40-50℃时、 A344E突变体仍然表现出高活性，保留了80%以上的初始活性。相比之下，S302I和S302M突变体的最适温度为50℃。在50-60℃，这些突变体仍然保留了50%以上的初始活性。

图3

接下来，作者检查了野生型和突变型酶在45℃下的热稳定性(图3b)。在45℃热处理20h后，野生型酶的残活力为58%，而突变体A344E的残酶活力仅为33%。结果表明，A344突变影响了L-天冬酰胺酶的热稳定性。野生型和A344E酶在45℃下孵育35h后，其残留酶活性分别仅为10%和3%。相比之下，S302I和S302M突变体保持了50%以上的初始活性。

PH是影响酶活性和稳定性的重要参数。适当的pH促进酶反应，而不适当的pH会破坏酶的结构，从而影响催化。如图3c所示，野生型和突变型酶在pH7.0时活性最高。相反，当pH值为4.0-5.0时，酶活性可以忽略不计。与重组酶相比，A344E突变体的相对活力较高，在pH6.0~9.0之间，酶活力保持在80%以上。还检测了野生型和突变型酶的pH稳定性，如图3D所示。虽然与野生型和其他突变酶相比，A344E突变体对酸和碱的抵抗力更强，但在所有情况下都观察到了类似的趋势。

以25mmol·L^-1天冬酰胺为底物，研究了不同金属离子(Na 、Mg² 、La³ 、Zn² 、Li 、Ca² 、K 、Mn² 、Ni² 、Co² 、Cu² 、Fe³ )对RmAsnase催化活性的影响。发现Cu² 、La³ 、Zn² 对L-天冬酰胺酶有明显的抑制作用。相反，Na 和Ca² 对酶的影响很小，所有被测试的金属离子都没有表现出活化效应。

图4

为了探讨突变酶热稳定性变化的原因，作者进行了分子动力学模拟研究突变前后RmAsnase的三维结构变化。结果表明，S302位于β折叠，突变后I302和M302仍可形成β折叠，蛋白质结构未发生明显变化(图5a)。302位残基没有与周围氨基酸形成氢键，突变后氢键数量保持不变。与第302位相邻的几个氨基酸残基，即V299、A301和L303都是疏水性氨基酸。因此，亲水性丝氨酸突变为疏水性异亮氨酸或甲硫氨酸可能会增加该区域的疏水性，提高蛋白质的稳定性。

同时发现302位氨基酸残基只与307位氨基酸残基相互作用；突变后，突变体中这两个氨基酸残基之间的距离缩短(图5a)。还可以看到S302与酶活性中心相邻(图5a)，异亮氨酸和蛋氨酸的侧链都比丝氨酸的侧链长。因此，作者推测S302I和S302M中较长的侧链导致容纳底物L-天冬酰胺的空间较小，这有利于酶与底物的正确结合，可能是比活力提高的原因。通过30 ns的分子动力学模拟，分析了野生型和突变型系统的动态行为。系统的稳定性用RMSD值来表征。如图5b所示，这三个系统具有相同的波动趋势。该系统在0-0.5 nm之间波动，直到在6 ns处达到平衡。这表明8~30 ns的模拟轨迹是稳定的和有代表性的。

图5

因此，为了进一步探讨热稳定性提高的原因，利用GROMACS软件对蛋白质分子动力学进行了模拟，确定了衡量蛋白质稳定性的均方根波动(RMSF)。结果如图5c所示。S302残基周围的一些区域在318K时WT的均方根值有很大的波动，通常这些氨基酸残基被认为是不稳定的。相反，两个突变体的均方根值表现出更多的微小波动。而突变体S302I(0.167)和S302M(0.170)的均方根值低于WT(0.184)。RMSF值的降低解释了突变体S302M和S302I更耐热的原因。

为了获得活性和热稳定性较好的酶突变体，作者将上述阳性突变体A344E、S302I和S302M组合，构建了A344E/S302I和A344E/S302M组合突变体。A344E/S302I和A344E/S302M组合突变体的比活力分别比野生型酶提高了43.8%和39.2%，与野生型酶相比，A344E/S302I和A344E/S302M的比活力分别提高了43.8%和39.2%。

进一步的酶学性质研究表明，A344E/S302I和A344E/S302M的最适温度为50◦C，比野生型提高了5◦C(图6a)。在50-60◦C温度范围内，A344E/S302I和A344E/S302M的相对酶活均高于野生型酶，且在45◦C时，A344E/S302I和A344E/S302M的热稳定性高于野生型酶(图6b)。在45◦C培养35h后，A344E/S302I和A344E/S302M的残酶活性分别约为65%和60%。相比之下，野生型酶仅保留了约10%的初始活性。

组合突变体和野生型酶的最适pH均为7.0(图6c)。此外，在测试的pH值为4.0-10.0的范围内，所有情况都观察到类似的趋势。在pH稳定性实验中，三种酶也表现出相似的结果(图6d)。

图6

枯草芽孢杆菌是一种常见的模式系统，人们对它的理解相对较好，通常认为在食品生产中使用是安全的，因为它在发酵过程中不会产生有毒的副产品。因此，作者选择枯草芽孢杆菌作为生产L-天冬酰胺酶的宿主。在此基础上，构建重组质粒pMA5-A344E/S302I，转化枯草杆菌168，获得枯草杆菌168-pMA5-A344E/S302I。而枯草芽孢杆菌168-pMA5-A344E/S302I的酶活力较低。肖等人设计了50个非翻译区(UTR)序列，有效提高了地衣芽孢杆菌DW2工业菌株的蛋白质产量。该序列仅包含约30个核苷酸，并在开放阅读框架之前形成发夹结构。据报道，该元件可增加目标蛋白的表达，并促进SD序列和起始密码子的可及性，从而提高翻译起始效率。因此，我们尝试应用UTR策略来提高L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的表达。结果表明，枯草杆菌168-pMA5-UTR-A344E/S302I的酶活从野生型的2.1U·mL⁻¹提高到13.3U·mL⁻¹，有效地提高了枯草杆菌L-天冬酰胺酶的表达。在5L生物反应器中进一步发酵重组枯草芽孢杆菌168-pMA5-UTR-A344E/S302I菌株。发酵结果如图7所示，重组菌在发酵22-26小时内达到稳定期。30h后，重组菌进入腐烂期。发酵各阶段L-天冬酰胺酶产量均随菌体生物量的增加而增加，发酵26h后菌体生物量达到最大值时，L-天冬酰胺酶活力高达521.9 U·mL⁻¹。

图7

整理：李岚雪

文章信息：

PMID: 34943261

PMCID: PMC8698271

DOI: 10.3390/biology10121346