生物膜在水产中应用（水产品中微生物生物被膜形成机制与控制方法）

生物膜在水产中应用（水产品中微生物生物被膜形成机制与控制方法）2 水产品中微生物生物被膜的控制措施 在水产品加工过程中，主要污染源通常是由于水产品加工设备的清洁和消毒不当造成。水产环境中，沙门氏菌来源于带菌者的粪便污染、水产品养殖环境及生产过程中的一系列环节。其中，THOMPSON 等报道了由于金枪鱼寿司卷的消费感染沙门氏菌，引起食物中毒的现象。食源性病原菌可在设备材料表面、地面、工厂天花板等形成微生物生物被膜。在产品表面也可能存在病原菌，进一步形成生物被膜。全球范围内，水产品传播的疾病主要由霍乱弧菌、副溶血性弧菌或创伤弧菌等引起。弧菌属中的副溶血性弧菌是主要食源性病原菌，其在亚洲国家尤为如此。海产品在制造，处理和加工过程中会受到产毒或非产毒霍乱弧菌污染。其中，单增李斯特菌在熏海鲜、虾、软体动物贝类等各种水产品中被检出，其可形成生物被膜，造成更大危害。1.1 水产品原料 水产品原料自身带有微生物源，当细菌在水产品中形成生物被膜时，其会长时间存活，并对

微生物生物被膜为微生物在特定条件下形成的一种特殊群体结构，是无柄微生物群落附着在各种载体上，通过分泌多糖、纤维蛋白与脂质蛋白等胞外基质，将载体包绕其中而形成的大量高度组织化、系统化的膜样聚合物。微生物菌体被包裹在其自身分泌的胞外聚合基质中，具有特定结构，是微生物在生长过程中形成的一种非游离状态的微生物细胞集合体。多糖、蛋白质、磷脂、磷壁酸与核酸等是 EPS 的主要组分。相对于以浮游方式存在的微生物，更多微生物以生物被膜形式存在。其还包括原生动物、真菌以及多种生物复合而形成的生物被膜。与浮游方式存在的微生物相比，微生物为适应生存环境形成的生物被膜危害更大、抗性更强、抑制或消灭也更困难。本文介绍了微生物生物被膜的形成过程与水产品中微生物的生物被膜现象，并对其控制措施予以说明，提出相应的问题与解决方案，以期为后期相关研究提供理论参考。

生物被膜中含有腐败菌与病原菌，其增加了水产品后处理的污染和对公众健康的风险。目前，在水产品中能形成生物被膜的常见微生物主要有沙门氏菌、嗜水气单胞菌、弧菌与单增李斯特菌等。由于这些微生物被膜的存在，构成了世界范围内的食品安全威胁。因此，控制水产品及其加工过程中的腐败和病原菌污染，防止其生成生物被膜进而交叉污染水产品，对控制一些食源性疾病的发生具有重要意义。其中，细菌生物被膜的动态形成过程复杂，包括初始细菌的附着粘附、群落形成、生物被膜的成熟与细菌的分散污染。细菌的附着和粘附是生物被膜形成的第一阶段与关键步骤。在细胞能结合到表面前，其表面通过吸附来自周围环境的分子而被调节。此外，吸附粘附取决于正在进行的食品加工的类型，可能在水产品产业中发现的有机物质（肌肉蛋白肌钙蛋白，原肌球蛋白和肌球蛋白），其组成将不同于乳制品工业中表面上沉积的有机物质（α-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白和 α-乳清蛋白），从而影响细胞保留与后续生物膜的结构功能。在生物被膜的成熟阶段，微生物包裹其自身分泌的多聚糖基质中，由扁平不均一结构变为高度组织化结构。最后，微生物细胞分散污染其他表面，重复循环，形成新的生物被膜，这也是微生物生物被膜难以控制的主要原因。

1 水产品中存在的生物被膜现象

生鲜水产品含水量高、营养丰富，其在贮藏与加工过程中极易受到污染，滋生微生物，形成微生物生物被膜，导致其腐败，这已成为水产品及加工品中存在的主要问题。

1.1 水产品原料

水产品原料自身带有微生物源，当细菌在水产品中形成生物被膜时，其会长时间存活，并对多数抗菌产品表现出抗性。细菌群体中含有对抗菌产品敏感性降低的亚群体，其可通过适应，产生遗传抗性元件，形成生物被膜并获得更高抗性，微生物生物被膜特殊的三维生物结构是抗菌产品的天然屏障。细菌生物被膜主要由微生物、微生物分泌的粘性物质和胞外多糖组成，其中微生物占比少于1/3。蛋白质、多糖、DNA、RNA 与磷脂等生物大分子同细菌存在于生物被膜中，约占其总量的3%，另有97％的水分。暴露于环境中的高浓度细菌与病毒可能形成生物被膜，并能长时间处于稳定状态。但当与环境和食物有关的因素给予这些生物被膜一定刺激时，其又回到浮游状态。如嗜水气单胞菌已从螃蟹、鲫鱼与鲳鱼等水产养殖产品中分离出，该菌会引发食用人群产生败血症等疾病。Panisello 等也关注了贝类和其他海产鱼类中污染沙门氏菌形成生物被膜引起的食源性疾病。

1.2 水产品加工过程

在水产品加工过程中，主要污染源通常是由于水产品加工设备的清洁和消毒不当造成。水产环境中，沙门氏菌来源于带菌者的粪便污染、水产品养殖环境及生产过程中的一系列环节。其中，THOMPSON 等报道了由于金枪鱼寿司卷的消费感染沙门氏菌，引起食物中毒的现象。食源性病原菌可在设备材料表面、地面、工厂天花板等形成微生物生物被膜。在产品表面也可能存在病原菌，进一步形成生物被膜。全球范围内，水产品传播的疾病主要由霍乱弧菌、副溶血性弧菌或创伤弧菌等引起。弧菌属中的副溶血性弧菌是主要食源性病原菌，其在亚洲国家尤为如此。海产品在制造，处理和加工过程中会受到产毒或非产毒霍乱弧菌污染。其中，单增李斯特菌在熏海鲜、虾、软体动物贝类等各种水产品中被检出，其可形成生物被膜，造成更大危害。

2 水产品中微生物生物被膜的控制措施

为确保水产品安全，水产品生态系统的每一步都需采取相应措施对生物被膜加以控制。主要方法有物理法、化学法、化学生物学法等。

2.1 物理法

1）高压处理：高压处理可通过破坏微生物生物被膜的结构，达到消毒和杀菌目的，一般可用于水产品加工处理。其中，莘似韵等使用高于300MPa 的超高压处理从水产品中分离的单增李斯特菌生物被膜，发现有2株 4b血清型细菌的被膜形成量都有显著降低。高压处理在某些情况能使牡蛎中总活菌数、乳酸菌、大肠菌群等减少约 5 个对数单位，400MPa，600s 是杀灭牡蛎中总菌数的最佳条件。从现有分析得知，超高压技术在水产品基础研究与产品项目开发上仍处于起步阶段，实际操作可配合酶处理与热加工等手段，拓展超高压在水产品加工中的使用领域。

2）超声波处理：超声波处理具有设备要求低、使用方便、处理迅速，且对原料及操作人员伤害极低等特点，在水产品加工业中前景广阔，现已逐渐应用于各类食品加工中。目前，超声波处理在消除细菌生物被膜方面应用广泛。相关报道显示，超声波处理能简单有效去除微生物生物被膜，其风险最小化，且能提高产品的一致性与综合质量。其中，杨葆华等使用超声波处理 120s，能消除多数金黄色葡萄球菌形成的生物被膜，且易于控制，人为影响较小。尽管较低频率的超声波在降低生物被膜内的细菌存活力方面较高频率更有效，但使用现有的超声波技术不能仅消除水产品及加工过程中的微生物，因此可将超声波技术与其他处理技术相结合。

2.2 化学法

1）消毒剂：在水产品加工过程中消毒剂可减少细菌在非生物表面形成生物膜，其是清除细菌生物被膜的必要条件。在水产品行业中，要有符合要求的清洁和消毒设施，使用消毒剂须安全有效、易于处理、无残留。常用消毒剂有臭氧、过氧化氢、氯、苛性碱、过乙酸、碘与异噻唑啉酮等。其中，李长青等研究得出，邻苯二甲醛消毒剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌与枯草杆菌黑色变种芽孢杀灭效果较好。但与浮游细胞相比，生物被膜对消毒剂的抗性更强。

2）天然抗菌剂：从芳香族植物中提取的一些抗菌化合物天然安全，现已证明对浮游细菌具有良好的抗微生物活性。如植物精油的次生代谢物具有抗微生物作用，其主要作用于微生物细胞质膜的脂质双层。相关报道显示，肉桂精油处理可使水产品生产加工中不锈钢表面上的无固定细胞数量减少 2.54个数量级，肉桂醛则被证明能减少或消除无菌细菌细胞，现已成为商业化学消毒剂的有效替代品。

2.3 化学生物学法

1）噬菌体：噬菌体在大自然中无处不在，是感染和裂解细菌的病毒，可控制霍乱弧菌、链球菌和大肠埃希菌等人类病原体，现已提议作为生物膜的控制方法之一。许多噬菌体都会产生解聚酶，通过EPS 扩散，产生的解聚酶会水解生物被膜中的胞外聚合物，引发其破坏。因此，需要进一步评估噬菌体在控制水产品传播的病原体方面的用途，改善水产品的安全性。但噬菌体的宿主范围很窄，因此噬菌体混合物或工程噬菌体可提供更好的解决方案。其中，Sillankorva 等研究了噬菌体Phi S1的特定裂解噬菌体作为荧光假单胞菌生物被膜控制剂的功效。发现其可感染浮游细胞和生物被膜，导致两种情况下生物量降低约 85％。研究表明，单裂解性噬菌体可通过解聚酶介导作用，显著根除旧生物膜。应用 P100噬菌体对单增李斯特菌的特异性生物防治也非常有效，与对照组相比，噬菌体 P100在第 0 d 和第 10 d 均能使单增李斯特菌数减少 2.5个对数单位。然而，目前仍需进一步研究使用噬菌体来彻底根除病原体。噬菌体与抗生素联用能使生物膜根除程度有所增强，其证实了噬菌体可增强抗生素功效的推测 。

2）益生菌：益生菌为“活性微生物的给药量足以为宿主带来健康益处”。其菌株可作为传统化学灭菌剂的替代方式，通过竞争、排斥和置换，有效减少水产品中沙门氏菌、单增李斯特菌等病原菌生物被膜的形成。Petrova 等研究发现益生菌菌株鼠李糖乳杆菌 GG 的凝集素对各种病原体的生物被膜形成具有明显的抑制作用，其还能破坏一些致病性病原体的成熟生物被膜。预防性使用益生菌，可提高养殖水生动物的健康和畜牧性能，溶藻弧菌现已被用作许多厄瓜多尔虾孵化场的益生菌，孵化时间从每月约 7 d 减少到每年约 21 d，而生产量增加了 35% 。

3）酶：酶是对特定化学分子具有催化活性的蛋白质，在食品加工过程中去除微生物生物被膜效果显著。由于生物膜基质中的异质性，选择恰当的酶处理方式很有必要，使用几种不同酶的混合物能增加其对水产品中生物被膜的降解与消除。相关学者在研究商业蛋白酶和淀粉酶对荧光假单胞菌形成的生物被膜的影响中发现，蛋白酶对荧光假单胞菌生物被膜 EPS 的降解效果较好，而淀粉酶的效果较差。微生物生物被膜的去除和杀灭处理条件苛刻，其中以蛋白酶与多糖水解酶作用效果较好。因此，根据安全无毒的特点，生物被膜的酶解控制技术可作为环保替代策略。

4）群体感应抑制剂：生物被膜中的微生物可通过信号分子进行交流，并使用群体感应优化其毒力因子，提高其生存能力。群体感应被广泛认为是调节微生物中共同行为特定基因表达的有效机制。前人研究发现，20μg/mL 北海苔藓虫中的次生代谢产物溴化生物碱就可引起微生物生物被膜信号分子的强度降低，阻断其生物被膜形成。螺旋藻提取物等群体感应抑制剂对生物被膜的抑制也具有良好效果，对水产品中希瓦氏菌腐败菌形成的生物被膜抑制率达 77.05% 。群体感应可调节生物膜中微生物的基因表达，但使用群体感应抑制剂解决上述问题还有待深入研究。

3 前景与展望

与浮游微生物相比，微生物为适应生存环境形成的生物被膜危害更大，抑制或消灭也更困难。水产品中的微生物生物被膜构成了世界范围内的健康威胁，几乎都可引起食源性疾病，严重程度从轻度肠胃炎到危及生命的感染，预防生物被膜形成比治疗生物被膜更加有效。因此，需要进一步研究用以解决水产品中生物被膜的抑制和消除问题，最大限度减少水产品污染，提高其安全性。然而，目前还未仅使用一种方法可完全消除生物被膜而无副作用，仍须通过栅栏因子将多种处理方式优化组合，发挥其协同作用，获得更有效的处理效果。因此，研究人员需更好完善微生物生物被膜的控制技术，确保消费者在水产品生产、加工、贮藏与食用等方面安全。